Mirando na produção do FGFR3 para resgatar o crescimento ósseo na acondroplasia

Nos últimos artigos revisamos brevemente algumas opções possíveis capazes de interromper a atividade do receptor de fator de crescimento de fibroblasto do tipo 3 (FGFR3) para bloquear os seus efeitos no condrócitos, a célula responsável por criar o modelo em que o osso vai ser construído. Devido à atividade excessiva do receptor (lembre-se, o FGFR3 é um freio natural que controla o ritmo de crescimento ósseo), condrócitos multiplicam (proliferam) menos do que o esperado, o que leva a um desenvolvimento ósseo prejudicado. O resultado clínico é a acondroplasia. Além de bloquear a atividade do receptor, há outras maneiras  para impedir o FGFR3 de exercer suas ações. Por exemplo, podemos também bloquear a sua produção.

No entanto, é importante compreender que FGFR3 não é um vilão. Este receptor é parte de um programa muito complexo que controla o crescimento ósseo. Não é aconselhável simplesmente abolir a sua produção, porque isso também poderia causar problemas. Então, como lidar com este desafio?

A produção do FGFR3

Antes de chegar à membrana celular, o FGFR3 deve ser expresso (produzido) pelo condrócitos. A ciência está apenas começando a desvendar a complexidade da maquinaria química que regula a vida, o que inclui a compreensão de como os genes são lidos e as proteínas são produzidas. Vamos falar um pouco sobre isso.

O código genético humano está organizado em cromossomos, estruturas químicas feitas de proteínas e DNA que carregam todos os genes. Temos dois pares de 23 cromossomos, e cada um desses pares de cromossomos é herdado de nossos pais (um da mãe, outro do pai). Isto também significa que nós ganhamos cada um dos milhares de nossos genes em pares, da mesma forma. Este link irá levá-lo a uma animação que mostra como os cromossomos são organizados. O fim vem com um bônus, que mostra como as células se multiplicam (proliferam).

Agora, vamos relembrar a natureza da  acondroplasia. A acondroplasia é uma condição genética autossômica dominante causada por uma mutação em apenas uma das duas cópias do gene FGFR3 que todos nós possuimos em nosso código genético. Em outras palavras, na acondroplasia, em vez de duas cópias similares e normais do gene FGFR3, o portador possui duas cópias diferentes, uma delas com a composição normal e a outra com a troca de nucleotídeos (G1138A) que causa esta condição. O gene alterado se sobressai em relação ao gene normal (é dominante). A dominância aqui é resultado da atividade excessiva da proteína mutante, o que no jargão é chamado de ganho de função.

Quando os condrócitos recebem uma ordem específica (um sinal químico), iniciam o processo pelo qual os genes FGFR3 (os dois) serão lidos, permitindo a produção da proteína FGFR3 (a normal e a mutante). Veja esta animação, que mostra como um gene é lido e como as informações necessárias para a produção de uma proteína são obtidas e processadas.

O processo pelo qual um gene é lido é chamado de transcrição. Basicamente, o gene feito de DNA será copiado (transcrito) na forma de uma molécula feita de RNA, que é chamado de RNA mensageiro (mRNA). O mRNA é dirigido para fora do núcleo da célula e levado para o ribossomo no citoplasma, onde vai ser lido, em um processo chamado de tradução (em português translation tem sido traduzido como translação). Pense no ribossomo, uma pequena organela celular, como uma linha de montagem em uma fábrica. Ele vai reconhecer a seqüência de nucleotídeos do mRNA e montará uma cadeia de aminoácidos, que serão escolhidos de acordo com essa seqüência. Veja este artigo que é uma rica fonte de informações sobre aminoácidos e sobre como eles são organizados para formar proteínas.

O processo todo é incrivelmente complexo e este texto e a animação que recomendei acima, embora se encaixem para explicá-lo, são simplificações. Vamos ver um pouco mais sobre o processo pós-transcrição, porque aqui existem algumas oportunidades onde podemos interromper a produção do FGFR3 mutante. Sem um super FGFR3, não teremos bloqueio do crescimento ósseo.

Entrando no núcleo da célula

Estamos longe de desligar um gene defeituoso diretamente no DNA. Por isso, não falaremos em corrigir a mutação. Embora não possamos mudar o código genético básico podemos, com certeza, mudar o que resulta desse código, apesar de que isso não é uma tarefa fácil.

O mundo do RNA

Vamos explorar um tema complexo. Às vezes, o texto poderá parecer um tanto árido. Caso isso pareça estar acontecendo, tente visitar as referências que eu estou incluindo no texto. Elas podem explicar de outra forma os processos que serão explorados aqui, o que pode ajudar a facilitar a compreensão.

Durante os últimos anos, tornou-se cada vez mais evidente que o RNA é muito mais do que um "servo" do processamento do código genético. Pesquisadores descobriram que o RNA tem várias outras funções relevantes além de ser um mensageiro do DNA, o que inclui a capacidade de regular o processo  do mRNA para a translação em proteínas. Em outras palavras, o RNA, em um dos vários formatos que pode assumir, pode definir qual gene poderá produzir uma proteína e qual não poderá, uma função muito poderosa.

Esta capacidade do RNA tem sido chamado de interferência de RNA (RNA interference) e vários tipos de moléculas de RNA podem interferir no caminho da produção de uma proteína. Antes de continuarmos, visite este link, patrocinado pela Nature (Jornal), que o levará a um vídeo em inglês muito ilustrativo (e técnico) que mostra a transcrição do DNA e também como é o mecanismo de interferência de RNA.

Micro RNAs

Se você assistiu o vídeo, aprendeu sobre os micro RNAs, ou miRNAs (ou miR n, onde n é um código numérico dado aos miRNAs). Os miRNAs são pequenos pedaços de RNA que podem identificar uma seqüência de nucleotídeos de um mRNA, se ligar a ele e parar o processo de translação do mRNA em uma cadeia de aminoácidos (a futura proteína). Muitos (centenas) miRNAs já foram descobertos e apresentam uma função de controle muito relevante na expressão da proteína (produção). A falta de um miRNA específico pode levar a várias doenças, porque se uma determinada proteína é liberada excessivamente as conseqüências podem ser prejudiciais para a célula (câncer, por exemplo). Você pode aprender mais sobre os miRNAs lendo este artigo na Wikipedia.

Em resumo, o modo de ação de um miRNA é o seguinte: cada miRNA tem uma seqüência de nucleotídeos que é complementar (que combina perfeitamente) com uma seqüência no mRNA alvo. Quando um miRNA se liga a um mRNA, o mensageiro não pode ser lido mais no ribossomo e é levado à degradação e a proteína não é produzida. A seqüência de nucleotídeos complementares é curta, então uma propriedade do miRNAs é que, embora eles sejam muito específicos para seus alvos, há vários mRNAs que apresentam a mesma seqüência complementar e, portanto, são alvos do mesmo miRNA.

Por exemplo, o miR 99a pode bloquear a leitura do mRNA FGFR3 que leva à produção da proteína FGFR3. Poderíamos usar o miR 99a para bloquear o FGFR3 na ACH? O problema aqui é que o miR 99a também bloqueia a expressão de outras proteínas, tais como a mTOR, que é uma enzima muito importante em processos celulares. Quando a doença é uma forma de câncer e ambos o FGFR3 e a mTOR estão influenciando o crescimento do tumor, pode ser interessante bloquear estas enzimas com um miRNA como o miR 99a. No entanto, qual seria o efeito desse tipo de ação em uma criança em crescimento? E quanto ao efeito nas outras enzimas além do FGFR3 bloqueadas por este miRNA controlador? Para saber mais sobre os testes feitos com o uso do miR 99a no FGFR3, visite o site da revista Oncogene para ler este artigo publicado em março de 2011.

Em suma, nós começamos a aprender sobre a existência de moléculas de RNA capazes de controlar a produção de proteínas. A primeira classe destes agentes RNA é representada pelos micro RNAs. Pelo menos um deles, miR 99a, poderia ser teoricamente utilizado na acondroplasia para controlar a produção de FGFR3. No entanto, a menos que haja um miRNA único e exclusivo, capaz de identificar a região mutante do mRNA transcrito do gene FGFR3  e se ligar a ele, administrar miRNAs como o miR99a não parece ser a melhor estratégia para tratar a acondroplasia. Os micro RNAs podem não ser a melhor ferramenta aqui, mas há outras.

Apenas começamos a explorar abordagens potenciais para parar ou reduzir a produção do FGFR3 para tratar as conseqüências da acondroplasia. O RNA tem mais a oferecer e vamos olhar para outra estratégia que pode ajudar a reduzir a parada de crescimento ósseo associada ao FGFR3 no próximo artigo. 

Targeting FGFR3 production to rescue bone growth in achondroplasia

In the last articles we briefly reviewed a number of potential options to stop the activity of the fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) to block its effects in the chondrocyte, the cell responsible for creating the template where the bone will be built. Due to the excessive activity of this receptor (remember, FGFR3 is a natural brake controlling the bone growth pace), chondrocytes multiply (proliferate) less than expected leading to an impaired bone development. The clinical result is achondroplasia. Besides blocking the receptor activity, there are other ways we can stop FGFR3 from exerting its actions. For instance, we can also block its production.

However, it is important to understand that FGFR3 is not a villain. This receptor is part of a very complex program that controls the bone growth. We would not like to simply abolish its production, because this could also cause trouble. So, how to manage this challenge?

FGFR3 production

Before reaching the cell membrane, FGFR3 must be expressed (produced) by the chondrocyte. Science is just beginning to unveil the complexity of the chemical machinery that governs life, which includes understanding how the genes are read and proteins are produced. Let´s talk a bit about this.

The human genetic code is organized in chromosomes, chemical structures made of proteins and DNA that carry all genes. We have two pairs of 23 chromosomes, and each chromosome of these pairs is inherited from our parents (one from the mother, one from the father). This also means that we earn each of the thousands of our genes in pairs, in the same way. The following link will take you to an animation which shows how chromosomes are organized. The end comes with a bonus, it will show you how cells multiply (proliferate).

Now, we must remember the nature of achondroplasia. Achondroplasia is an autosomal dominant genetic condition caused by a mutation in just one of the two FGFR3 gene copies everyone has within the genetic code. In other words, in achondroplasia, instead of two similar copies of normal FGFR3 genes, the carrier has two different copies, one of them with the normal composition and the other bearing the nucleotide switch (G1138A) which causes this condition. The altered gene rules over the normal one (it is dominant). The dominance here is a result of the excessive activity of the mutated protein, which in the jargon is called gain-in-function.

When the chondrocyte receives a specific order (a chemical signal), it starts the process by which the FGFR3 genes (both of them) will be read, allowing the production of the protein FGFR3 (the normal and the mutated ones).  Take a look in this animation, which shows how a gene is read and the information required to the production of a protein is obtained and processed.

The process by which a gene is read is called transcription. Basically, the gene made of DNA will be copied (transcribed) in the form of a molecule made of RNA, which is called messenger RNA (mRNA). The mRNA is driven out of the cell nucleus and taken to the ribosome in the cytoplasm, where it will be read, in a process called translation. Think in the ribosome, a small cell organelle, as an assembly line. It will recognize the sequence of nucleotides and create a chain of amino acids, which will be chosen according to that sequence. Take a look to this article in Wikipedia, which is a rich source of information about amino acids and how they are organized to form proteins.

The whole process is incredibly complex and this text and the animation I recommended above, although fits to explain it, are also simplifications. Let´s see a bit more about the post-transcription process, because here we have some opportunities where we can stop the mutated FGFR3 to be produced.  No pumped FGFR3, no bone growth arrest.

Getting into the cell nucleus

We are still far from knocking down a bad gene directly in the DNA. Thus, we will not talk about correcting the mutation itself. Although we cannot change the basic DNA code we can, for sure, modify the result of it, although it is not a simple task.

The RNA world

We are going to explore a complex topic. The text may seem sometimes quite arid. If this happens, try visiting the references I am including in the text. They could explain in other ways the processes we will be exploring, which in turn can help facilitate the understanding.

During the last years, it has become increasingly evident that RNA is much more than a ‘servant’ of the genetic code processing. Researchers discovered that RNA has several other relevant distinct functions than being a messenger of DNA, which includes the ability of regulating the progress of the mRNA to protein translation. In other words, RNA, in one of the several formats it can assume, can tell which gene will make a protein and which one not, a very powerful function.

This ability of RNA has been called RNA interference and several kinds of RNA molecules may interfere in the protein production path. Before we continue, visit this link, sponsored by Nature (the Journal), which will take you to a very illustrative (and technical) animation which shows DNA transcription and also how the RNA interference mechanism works.

Micro RNAs

If you watched the video, you learned about the micro RNAs, or miRNAs (or miR n, where n is a numeric code given to miRNAs). The miRNAs are small pieces of RNA that can identify a sequence of nucleotides within a mRNA, binds to it and stop the process of translation of the mRNA into a chain of amino acids (the future protein). Many (hundreds) miRNAs have already been discovered and they play a very relevant control function on protein expression (production). The lack of a specific miRNA can lead to several diseases, because if a given protein is released excessively the consequences may be harmful for the cell (for instance, cancer). You can learn more about miRNAs reading this article in Wikipedia.

In short, the mode of action of a miRNA is as following: each miRNA has a sequence of nucleotides that is complementary (it combines perfectly) to a sequence in the target mRNA. When a miRNA binds to a mRNA, the messenger cannot be read anymore in the ribosome and is driven to degradation and the protein is not produced anymore. The complementary nucleotide sequence is short, so one property of the miRNAs is that although they are very specific for the targets, there are several mRNAs bearing the same complementary sequence and therefore are targets of the same miRNA.

For instance, the miR 99a can hinder the FGFR3 mRNA to be translated into the protein FGFR3. Could we use miR 99a to block FGFR3 in achondroplasia? The problem here is that miR 99a also blocks other protein expression, such as of mTOR, which is a very important enzyme in cellular processes. When the disease is cancer and both FGFR3 and mTOR are influencing the tumor growth, it may be interesting to block these enzymes by a miRNA like miR 99a. However, what would be the effect of this kind of action in a growing child? What about the other enzymes else than FGFR3 being blocked by this controller miRNA? To learn more about the tests made with the use of miRNA 99a in FGFR3, please visit the Oncogene Journal website to read this paper published in March 2011.

In summary, we have briefly started to learn about the existence of RNA molecules capable of controlling the production of proteins. The first class of these RNA agents is represented by the micro RNAs. At least one of them, miR 99a, could be theoretically used in ACH to control FGFR3 production. However, unless there is an unique and exclusive miRNA capable of identifying the mutated region of the FGFR3 mRNA transcript and bind to it, giving miRNAs like the miR99a does not seem to be the best strategy to treat achondroplasia. Micro RNAs maybe not the best tool, but there are others.

We have just started to explore potential approaches to stop or reduce the production of FGFR3 to treat the consequences of achondroplasia. RNA has more to offer and we will look at another strategy that may help manage the FGFR3 associated bone growth arrest in the next article.

Reduzindo a influência do FGFR3 na acondroplasia, parte 4

Estamos seguindo o receptor de fator de crescimento de fibroblasto do tipo 3 (FGFR3) para identificar onde é possível interferir em sua atividade para contrabalançar os efeitos negativos que esse receptor produz na acondroplasia.

Nós exploramos a extremidade extracelular (domínio) do receptor, onde aptâmeros poderiam ser desenvolvidos para bloquear o sítio de acoplamento dos FGFs. Atravessamos a membrana plasmática para ver o que chamamos de domínio transmembrana onde pequenos peptídeos, aos quais denominamos interceptadores transmembrana, poderiam ser criados para impedir a formação do dímero.

Nós também aprendemos sobre como fechar as áreas ativas do FGFR3 em seu domínio intracelular com drogas específicas, os inibidores de tirosinoquinase (TKIs). Fechar os plugues elétricos do FGFR3 pelos TKIs interromperia toda a cascata de sinalização elétrica/química. A conseqüência esperada é que os condrócitos seriam capazes de proliferar mais, amadurecer (hipertrofiar) e dar espaço para o osso, restaurando um crescimento ósseo normal (ou quase normal).

Agora, vamos descer na cascata de sinalização do FGFR3.

Podemos pensar na cascata de sinalização do FGFR3 como uma cadeia de dominós. Quando a primeira peça é empurrada contra a segunda, a fila inteira seguirá, com uma peça caindo atrás da outra, como em uma reação em cadeia. No nosso caso, o FGFR3 é a primeira peça da fila e uma vez ativado ele ligará outras peças do dominó (enzimas). Agora, pense no que aconteceria se retirássemos uma ou duas peças do meio da cadeia de dominós. O sinal iniciado pelo FGFR3 não alcançaria seus alvos no núcleo da célula, dessa forma não causando os efeitos pelos quais ele é responsável.

Na última década, pesquisadores têm aprendido como o FGFR3 influencia o crescimento ósseo através do bloqueio do que eles acreditavam serem as suas cascatas de sinalização. É dessa maneira que hoje sabemos quais são as enzimas relevantes para o FGFR3. Veja a revisão escrita pelo Dr. Horton para ver uma figura que mostra a cascata de sinalização do receptor.

Simplificando bastante, nós poderíamos descrever uma das cadeias mais relevantes do FGFR3 assim:

FGFR3 > FRS2a/SOS/Grb > Ras > Raf > MEK > ERK/p38 > Núcleo

A outra cadeia importante é mais curta:

FGFR3 > JAK > STAT1 > Núcleo

Cada um dos acrônimos acima representa uma enzima (ou, por analogia, uma peça do dominó).

Em teoria, poderíamos parar a sinalização do FGFR3 bloqueando qualquer enzima nessa cadeia de dominós. Testes têm sido realizados com diferentes métodos de inibição de enzimas e os resultados confirmam a relevância dessas enzimas para o crescimento ósseo. Por exemplo, um estudo demonstrou que a inibição de ERK1 e ERK2 restaurou o crescimento ósseo e resgatou o estreitamento do canal espinhal em um modelo animal.

Quanto mais alta a posição da enzima na cadeia de dominós, mais amplo seria o efeito de seu bloqueio. Por outro lado, quanto mais baixo na cadeia, mais específico seria o efeito de se retirar a peça do dominó.

Contudo, inibir enzimas na cascata de sinalização do FGFR3 não é tão simples. As enzimas que respondem ao FGFR3 reagem também a vários outros receptores, incluindo outros FGFRs (revisto em um texto prévio). Em outras palavras, existe um risco de que ao bloquear, por exemplo, a enzima RAF, nós nos depararíamos com efeitos secundários devido ao bloqueio da sinalização desses outros receptores. Isto certamente não seria desejável em uma criança com o corpo em crescimento. O risco existe porque apesar do FGFR3 ser produzido de forma praticamente exclusiva pelos condrócitos, as outras enzimas da cadeia de dominós são produzidas por muitas outras células em outros tecidos. O que aconteceria se nós déssemos um anti-ERK para tratar ACH? Que tipo de efeitos em outras células e, por extensão, em outros tecidos e órgãos do corpo nós poderíamos esperar?

Em  uma criança com acondroplasia tudo está normal, com exceção de uma única proteína (FGFR3) produzida por um único tipo de célula (o condrócito), localizada em um tecido muito especial (a placa de crescimento cartilaginosa). Somando todo conhecimento hoje disponível sobre o FGFR3 e suas funções, parece fazer mais sentido que atinjamos o FGFR3 diretamente, do que outras enzimas de sua cascata de sinalização.

Em resumo, nós revisamos nesta série de textos onde poderíamos interferir na função do FGFR3 para reduzir sua atividade de um modo que poderíamos restaurar, ao menos parcialmente, o crescimento dos ossos. Até este momento, existem pelo menos três diferentes estratégias potenciais: os aptâmeros, os interceptadores transmembrana e os TKIs. Em termos do estado de desenvolvimento o mais promissor hoje são os TKIs.

Temos trabalhado na enzima FGFR3, a partir do momento em que ela é ativada na membrana celular. É possível interferir com a produção do FGFR3? No próximo artigo vamos visitar o núcleo do condrócito e procurar por oportunidades onde poderíamos obstruir a produção do FGFR3 mutante. Se a enzima alterada não é produzida, não pode parar o crescimento ósseo.

Reduzindo a influência do FGFR3 na acondroplasia, parte 3

Câncer é a área terapêutica na qual a indústria farmacêutica tem investido mais recursos para encontrar novos tratamentos (veja aqui). Existem várias razões para isso incluindo o fato de que o câncer está se tornando mais comum como consequência do envelhecimento progressivo da população mundial.

O que câncer tem a ver com acondroplasia ?

O câncer tem muitas facetas e novas medicações para combater esta doença (ou doenças) desafiadora estão sendo desenhadas agora para bloquear os mecanismos pelos quais as células cancerosas se tornam capazes de sobreviver, se multiplicar e se espalhar pelo corpo (metastatizar). Não é surpresa descobrir que os mecanismos usados pelas células cancerosas são os mesmos das células normais, mas em uma intensidade desproporcional.

Por exemplo, as células cancerosas se aproveitam das propriedades funcionais das enzimas receptoras celulares tais como o receptor de fator de crescimento de fibroblasto do tipo 3 (FGFR3). Como você pode recordar, a atividade excessiva do FGFR3 reduz o ritmo de proliferação (multiplicação) e de diferenciação ou hipertrofia (maturação) do condrócito, o que por sua vez leva à parada do crescimento do osso. Em alguns tipos de câncer, tais como o mieloma múltiplo e o câncer de bexiga, a ativação do FGFR3 provoca exatamente o efeito oposto: as células doentes se multiplicam livremente e o câncer cresce sem parar.

Saber como enzimas, tais como o FGFR3, são utilizadas pelo câncer faz delas alvos naturais para novas terapias. Neste sentido, a acondroplasia tem se beneficiado bastante com a pesquisa contra o câncer.

Vamos começar a olhar para reações químicas celulares aqui e o texto poderá não ser exatamente como o de uma receita de bolo de chocolate. Por isso, andaremos passo a passo e eu vou tentar ilustrar o melhor possível para torná-lo mais fácil para o leitor.

Já aprendemos que podemos bloquear o FGFR3 fora da célula com anticorpos ou aptâmeros (veja os artigos anteriores). Também podemos inibir o FGFR3 no interior da célula. Na última década, resultantes do aumento do conhecimento da maquinaria celular, surgiram os inibidores de tirosina quinase (TKI), uma grande classe de drogas que bloqueiam a ativação de enzimas receptoras no interior das células.

Os inibidores de tirosina quinase 

Diversos TKIs já estão sendo utilizados no tratamento de muitos tipos de câncer. Eles agem impedindo o fenômeno que inicia a cascata de sinalização da enzima depois que um ativador do receptor se liga a ele, fora da célula. Tomando como exemplo o FGFR3, já vimos isso: o FGFR3 é “ligado” quando um ativador (um ligante, um FGF) se liga ao seu domínio extracelular. O receptor atrai outro FGFR3 e eles formam um casal (um dímero). O dímero modifica seu corpo conjugado, provocando a exposição dos chamados bolsos de adenosina trifosfato (ATP) na parte intracelular de ambos os receptores, que são como tomadas elétricas. Esses plugues elétricos atraem as moléculas de ATP. Pense nos ATPs como baterias capazes de transferir energia através de cabos em um carro. No caso dos ATPs, esta transferência de energia é realizada pelo deslocamento de átomos carregados (íons). A chegada e o acoplamento dos ATPs com fosfatos carregados aos bolsos de ATP, o que nós denominamos fosforilação, vai atrair outras proteínas nas proximidades, uma após a outra, produzindo a cascata de reações químicas que, no final, irá estimular o núcleo da célula para a produção de novas proteínas ou inibir a produção de outras, ou irá estimular ou bloquear a capacidade da célula para se multiplicar.

O evento descrito aqui não é exclusivo do FGFR3: os outros FGFRs e muitas outras enzimas receptoras fazem o mesmo para transmitir seus sinais ao núcleo. Este é um conceito importante porque representa um dos grandes desafios para encontrar o bloqueador de TKI certo para o FGFR3. Este link irá levá-lo a uma animação que mostra a cascata de sinalização do receptor de fator de crescimento epidérmico (EFGR), que é uma enzima receptora que trabalha de um modo similar ao do FGFR3 (você vai precisar assistir apenas aos dois primeiros minutos da animação).

TKI são pequenas moléculas desenhadas para se ligar e “fechar” os bolsos de ATP nos domínios intracelulares das enzimas receptoras. Eles funcionam como aquelas capas que usamos nas tomadas para proteger as crianças de choques elétricos (figura).

  

Antes de continuarmos, convido você a seguir este link, que o levará a uma animação que mostra o mecanismo de ação do lapatinibe, um TKI desenhado para bloquear o EGFR. Isto é apenas para fins de ilustração da ação de um TKI e não se destina de modo algum a promover a droga.

A ideia é simples: com os bolsos de ATP fechados, os ATPs não podem transferir fosfatos e a cascata de sinalização não inicia. Parece uma solução atraente. As moléculas de TKI são pequenas e eficazes, então qual é o problema?

Os bolsos de ATP apresentam grande homologia (têm estruturas semelhantes) na maioria das enzimas receptoras, então a chance é grande de que um TKI em particular irá bloquear várias enzimas distintas pertencentes à famílias diferentes. Esta é a realidade. Já existe um bom número de inibidores de FGFR desenvolvidos (veja uma lista pequena e parcial abaixo). Você percebe que eu não coloquei um número após o acrônimo da enzima. Isto significa que é muito provável que um TKI desenhado para bloquear um dos FGFRs irá muito provavelmente bloquear todos os outros, também, dada a semelhança que compartilham. Na verdade, os primeiros TKI desenvolvidos bloqueiam um grande número de enzimas distintas. Os mais recentes são mais específicos, como resultado do melhor entendimento das interações químicas entre as moléculas e também com o lançamento de programas mais sofisticados de design de moléculas. 

TKIs anti-FGFR disponíveis:

• PD173074
• PD106067
• TKI258 (dovitinib)
• Brivanib

Uma questão que naturalmente ocorre a alguém que pensa no tratamento da acondroplasia: TKIs alcançam a placa de crescimento? A resposta é sim. Por exemplo, testes feitos com o PD176067 mostraram aumento em ambas as zonas proliferativa e hipertrófica da placa de crescimento cartilaginosa, um efeito que foi considerado uma reação direta ao composto testado.

Os TKIs listados acima bloqueiam o FGFR3, mas também os outros FGFRs e / ou enzimas das famílias PDGFR (receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas) e VEGFR (receptor do fator de crescimento endotelial vascular). Este link leva você a uma recente revisão técnica sobre a inibição dos FGFRs em câncer.

Recentemente, trabalhos com dois novos inibidores do FGFR3 foram publicados: o NF449 e o A31. Ambos parecem mostrar atividade mais específica contra o FGFR3 do que outros compostos predecessores. Se os testes pré-clínicos continuarem a trazer resultados positivos, uma molécula como a A31 poderia chegar à fase clínica em três a cinco anos.

Em resumo, inibidores da tirosina quinase apresentam várias evidentes características positivas:

• São pequenos
• Alcançam a placa de crescimento
• Podem ser administrados por via oral
• Estão se tornando mais e mais específicos (na acondroplasia, eles têm que ser)

TKIs são uma opção promissora para o tratamento da acondroplasia. É necessário redobrar os esforços para aumentar a velocidade da pesquisa para o desenvolvimento desses compostos mais específicos.

No próximo artigo, vamos continuar nossa jornada no interior do condrócito. Ainda temos outras opções em termos de bloqueio da sinalização do FGFR3. 

Reduzindo a influência do FGFR3 na acondroplasia, parte 2

Mirando no FGFR3 no interior do condrócito

A inibição da atividade do receptor do fator de crescimento de fibroblasto do tipo 3 (FGFR3)  na acondroplasia (ACH) pode restaurar, ao menos parcialmente, o crescimento ósseo, o que pode prevenir as complicações ortopédicas comuns que a maioria das crianças afetadas sofrerá durante a infância e, consequentemente, pode também reduzir as complicações esqueléticos e neurológicas muito conhecidas comumente vistas na vida adulta.

No último artigo, fizemos uma breve revisão de potenciais abordagens visando a inibição do FGFR3 para reduzir a sua atividade na ACH, fora do condrócito. Vamos começar a mergulhar no condrócito, olhando onde mais podemos interferir no FGFR3 hiperativo.

Interceptadores transmembrana  

A primeira parada que iremos fazer é dentro da membrana celular, a capa que protege o conteúdo da célula e funciona como um portão. Como você deve lembrar, o FGFR3 é posicionado através da membrana celular de condrócitos. O FGFR3 é constituído de três partes, chamadas domínios extracelular, transmembrana, e intracelular. Vamos dar uma olhada no domínio transmembrana.

Quando o FGFR3 é ativado por um FGF, atrai outro receptor e os dois FGFR3s  formam o que é chamado de dímero. Os corpos de ambos os receptores se alinham de forma a permitir a exposição dos sítios de ligação de fosfato (os bolsos de ATP) mencionados em um artigo anterior), que são como tomadas elétricas. Esses plugues elétricos são aqueles que irão iniciar a cascata de sinalização do FGFR3.

É possível desenvolver compostos capazes de impedir o alinhamento do dímero. Estas moléculas têm sido chamadas  de interceptadores transmembrana. O conceito é usar a propensão que as enzimas receptoras (como o FGFR3) têm de atrair uma a outra para formar o dímero. Pode-se construir uma cadeia de aminoácidos, que chamamos de peptídeo, com a mesma composição e atratividade do domínio transmembrana do receptor. Este peptídeo poderia então ser usado como concorrente do receptor real. Se o receptor ativado se liga ao peptídeo, não pode atingir a configuração correta para ativar os plugues elétricos e permanecerá sem sinalizar para o interior da célula. Experimentos conceituais já foram realizados com um modelo de FGFR3 pelo grupo da Dr. Kalina Hristova, um dos pesquisadores que têm dedicado grandes esforços para entender o FGFR3 e suas características biológicas, veja aqui. Para mais informações técnicas, há uma boa revisão publicada na revista Science Signaling.

A pesquisa com esses "interceptadores" ainda está no começo, mas há alguns aspectos positivos nesta potencial abordagem: é provável que um peptídeo direcionado para domínio transmembrana do FGFR3 seria muito específico, não teria que entrar na célula e sofrer com os mecanismos de defesa celular e, talvez tivesse o tamanho correto para alcançar os condrócitos através da placa de crescimento.

No próximo artigo vamos analisar a classe atualmente mais promissora de drogas desenhadas para bloquear receptores e enzimas intracelulares, os inibidores da tirosina quinase.

Reduzindo a influência do FGFR3 na acondroplasia, parte 1

Como já vimos ​(artigos anteriores), as principais alterações que prejudicam o crescimento ósseo na acondroplasia são causadas ​​pelo excesso de atividade do receptor do fator de crescimento de fibroblasto do tipo 3 (FGFR3) devido a uma mutação (troca) simples nessa proteína.

Como podemos gerenciar este receptor workaholic? Como podemos reduzir ou abolir atividade do FGFR3 ou contrabalançar os seus efeitos nos condrócitos, as células que, em última instância, são responsáveis pela criação da base onde os ossos são construídos? Se eles não se multiplicam (proliferação) e crescem (hipertrofia), haverá menos base para o osso a crescer.

Vimos como o FGFR3 funciona, como ele é produzido e como ele é conduzido para a desativação. Vamos começar agora a ver as muitas possibilidades para lidar com ele, começando por examinar diretamente como bloquear ou inibir a atividade do FGFR3.

Quando alguém pensa sobre o tratamento da acondroplasia o primeiro pensamento natural é: “temos que acabar com este receptor. Ele tem de parar de exercer suas ações.”

Mirando o FGFR3 de fora da célula

Estes foram muito provavelmente os primeiros pensamentos dos pesquisadores desde que o defeito básico da acondroplasia foi identificado. No entanto, desde o início, a tarefa também se mostrou bastante complexa. Você deve se lembrar que mencionamos que a placa de crescimento é um ambiente muito bem protegido. Não há vasos sanguíneos em seu interior, logo não há fluxo de sangue direto para levar oxigênio e nutrientes aos condrócitos. O meio ambiente local, ao qual chamamos matriz da cartilagem, é um terreno denso e tudo que é direcionado aos condrócitos deve passar por este território. Um estudo publicado em 2006 por Farnum et al. mostrou que moléculas de baixo peso molecular podem trafegar na placa de crescimento e que as moléculas maiores do que 40kDa provavelmente sofrem maior resistência para difundir neste ambiente (kDa significa kilodalton, onde dalton é uma unidade de medida de peso molecular).

Anticorpos

Aprender sobre o tráfego de placa de crescimento pode ajudar a explicar muita coisa sobre as primeiras interessantes  experiências  feitas com anticorpos específicos contra o FGFR3. Proteínas têm a propriedade de provocar reações do sistema imunológico. Quando uma proteína não-self (uma proteína que não pertence ao corpo) é exposta ao sistema imunológico, a defesa do corpo geralmente produz anticorpos específicos para ligar e bloquear o “'invasor”. Esta propriedade das proteínas é largamente utilizada na criação de anticorpos terapêuticos para o tratamento de muitas doenças. Também devemos ter em mente que os anticorpos são como as proteínas, eles também podem provocar respostas imunes contra eles.

Por exemplo, anticorpos contra enzimas receptoras como o FGFR3 estão sendo usados ​​para tratar alguns tipos de câncer. Um bom exemplo é o trastuzumabe, um anticorpo que foi desenhado para bloquear a atividade de uma enzima receptora chamada de receptor do fator de crescimento epidérmico (ou EGFR) para tratar o câncer de mama. O EGFR é, como o FGFR3, posicionado através da membrana celular, com uma porção extracelular (ou domínio) em contato com o meio ambiente. O anticorpo deixa a circulação e se liga ao receptor, bloqueando seu local de encaixe à molécula ativadora (EGF). Assim, um anticorpo trabalha fora da célula. A principal diferença aqui é que o tecido mamário é bem coberto por uma rede de vasos sanguíneos. A cartilagem não é. Você pode ver a forma como funciona o trastuzumabe assistindo a esta curta animação (sem áudio).

Em 2003, um grupo israelense publicou os resultados de testes feitos com um anticorpo específico contra o FGFR3, chamado PRO-001 (Aviezer et al.). Os testes foram realizados em ossos de ratos e os resultados foram promissores. No entanto, desde então, não houve novas publicações e a razão (não temos certeza) poderia ser que um anticorpo convencional normalmente pesa 150 kDa ou mais, por isso não pode trafegar livremente através da matriz da cartilagem, sendo provavelmente eliminado do sangue antes de pode atingir seu alvo em uma concentração terapêutica. É provavelmente o tamanho das moléculas dos anticorpos que impede o seu uso terapêutico na acondroplasia  Você pode encontrar mais informações técnicas sobre o uso de anticorpos para bloquear o FGFR3 lendo o editorial do Dr Joseph Schlessinger, onde ele comenta as conclusões de um estudo com outro anticorpo anti-FGFR3 chamado R3Mab aqui. 

Então, aqui vai uma primeira recomendação a quem pesquisa uma abordagem terapêutica para a acondroplasia: a molécula deve ser pequena, provavelmente com peso inferior a 50kDa.

Mantendo a visão de fora da célula, existe alguma outra forma pela qual poderíamos bloquear o encaixe de ativadores (ou ligantes, os FGFs) do FGFR3 para que o receptor seja mantido desligado?  A resposta é sim.

Durante as últimas décadas, pesquisadores têm aprendido muito sobre a interação das proteínas com os ácidos nucléicos (DNA, RNA), que vamos chamar de nucleotídeos a partir de agora. Existem várias proteínas capazes de se ligar diretamente ao DNA (por exemplo, as proteínas “alfaiates” que eu mencionei em um artigo anterior) e RNA. Bem, por que não fazer o inverso, através da síntese de moléculas de nucleotídeos que podem se ligar diretamente a proteínas? Isso já foi feito, e as moléculas feitas de nucleotídeos (citamos como oligonucleotídeos) com essa finalidade são chamadas de aptâmeros.

Aptâmeros

Aptâmeros são muito específicos para os seus alvoss em um grau semelhante aos anticorpos convencionais. Além da especificidade semelhante, aptâmeros têm uma série de vantagens em relação aos anticorpos. Primeiro, eles são muito menos imunogênicos do que os anticorpos (o que significa que eles não causam o mesmo nível de reações de defesa imunológica que os anticorpos terapêuticos). A segunda característica importante e positiva é que aptâmeros costumam pesar de 15 a 45kDa.

Há pelo menos um aptâmero terapêutico já no mercado (pegaptanib), projetado para tratar uma condição oftalmológica, e há outros em ensaios clínicos para várias indicações. Até o momento, não há nenhuma pesquisa publicada de aptâmeros contra FGFR3. Uma consulta simples no Pubmed não identificou qualquer trabalho (palavrras-chave: aptamer, FGFR3, 29 de dezembro de 2011).  Aptâmeros representam uma tecnologia nova e há muitas perguntas a serem respondidas em relação à sua utilidade no tratamento de muitas doenças. Por exemplo, a cartilagem não é o tecido preferencial para depósito de aptâmeros. Não sabemos se um aptâmero específico contra o FGFR3 atingiria o alvo. Há apenas uma maneira de saber, que é testar a hipótese.

Você pode ler mais sobre aptâmeros aqui. Para mais informações técnicas, há essa boa revisão.

Concluindo, aptâmeros são uma abordagem em potencial a ser explorada para acondroplasia por várias razões:

• Trabalham fora da célula
• São pequenos
• São muito específicos
• Não são imunogênicos
• Têm um bom perfil de segurança

Em resumo, analisamos alguns dos desafios para o tratamento de acondroplasia. O primeiro é fazer a droga chegar ao alvo. Também discutimos brevemente duas opções para bloquear o FGFR3 de fora da célula. Uma já está disponível, que são os anticorpos específicos contra o receptor. O segundo é um potencial ainda a ser explorado, os aptâmeros.

No próximo artigo, vamos continuar a nossa análise sobre as terapias em potencial para acondroplasia visando o bloqueio direto ou a inibição do FGFR3, desta vez à procura de abordagens de dentro da célula.