Tratando a acondroplasia: os testes com o BMN-111 em camundongos

A Biomarin e o grupo francês chefiado pela Dra. Laurence Legeai-Mallet acabaram de publicar no American Journal of Human Genetics um estudo de avaliação dos efeitos do BMN-111 em camundongos: http://www.cell.com/AJHG/abstract/S0002-9297 (12) 00537-X.

O que é importante sobre este estudo?

Este estudo é importante porque traz resultados mais consistentes dos testes feitos com o análogo do peptídeo natriurético tipo C (CNP) em um modelo animal de acondroplasia.

Nós já revimos o CNP neste artigo anterior, mas acho que vale a pena ver de novo alguns conceitos. Pode parecer difícil de entender as questões, dada a multiplicidade de siglas, expressões ou o jargão utilizados na linguagem da ciência. Em uma recente mensagem um pai me pediu para explicar mais as implicações deste estudo, de uma forma mais amigável. Vou tentar.

Dessa forma, vamos falar sobre alguns conceitos que podem ajudar o leitor interessado, mas não especialista, a entender as implicações do uso de um análogo do CNP no tratamento da acondroplasia.

O que é o CNP? O que é um peptídeo?

O CNP é uma molécula relativamente pequena chamada peptídeo e é composto por uma cadeia de aminoácidos naturalmente produzida pelas células do nosso corpo. Ele é feito da mesma maneira que as proteínas são: existe um gene no DNA que o codifica (carrega a informação química necessária para produzi-lo). Imagine que o CNP é uma espécie de combinação multicolorida de blocos de lego. Proteínas e peptídeos são exatamente a mesma coisa, sendo denominados de uma forma ou outra de acordo com seu tamanho, sendo os peptídeos menores que as proteínas.

Também já vimos que muitas proteínas são chamadas de enzimas dadas as suas propriedades químicas. Essas enzimas podem catalisar (provocar) reações químicas (grosseiramente, pequenos choques eléctricos provocados pela transferência de átomos carregados ou elétrons) que por sua vez irão gerar reações nas células. Proteínas e peptídeos são de fato os grandes mestres da vida, governando todos os aspectos da vida como a conhecemos.

A Natureza é inteligente e durante os milhões de anos de evolução da vida, fez incontáveis experiências químicas ​​para criar peptídeos e proteínas com propriedades cada vez mais específicas. Assim, estas moléculas, embora carregadas eletricamente, apenas reagem com outras moléculas específicas (ou alvos) que se combinam com elas, da mesma forma que combinamos certos blocos do lego com alguns outros, mas não com todos eles.

Esta especificidade das proteínas e peptídeos é tão importante que as principais moléculas dessa classe, que regem as reações-chave que permitem a vida, têm uma estrutura básica principal muito bem conservada na maioria das formas de vida. Em tais proteínas, dependendo da espécie, vamos encontrar algumas trocas de aminoácidos, alguns faltando, alguns adicionados, mas a estrutura principal vai estar lá, não importa o animal que estudarmos. Por que estamos falando sobre isso? Bem, acho que alguém poderia perguntar por que estamos testando um rato para ver se um peptídeo pode funcionar no homem, não é? A razão simples é que o CNP (ou uma molécula semelhante) está presente no homem e nos ratos e na maioria (ou todas?) das formas de vida mais avançadas na Terra. E o mais importante: ele faz a mesma coisa em todos elas. O mesmo é válido para o receptor de fator de crescimento de fibroblasto do tipo 3 (FGFR3).

O que tudo isso tem com acondroplasia?

Vamos continuar nossa pequena viagem revendo o que estas proteínas e peptídeos fazem.

As proteínas podem atuar do lado de fora, através de e no interior das células. Aprendemos aqui que o FGFR3, uma proteína com propriedades elétricas, e portanto, uma enzima, está localizado desativado e atravessado na membrana celular do condrócito. Ele funciona como uma antena, transmitindo as mensagens de fora para permitir que a célula possa reagir de forma correta. O FGFR3 fica ali, à espera de ser ativado por uma outra... proteína que, neste caso, é um fator de crescimento de fibroblastos (FGF). Quando uma proteína ou um peptídeo age de tal maneira, a partir de uma reação de ligação ao seu alvo, chamamos de ligante (ligand em inglês, do latim, significando aquele que se liga ao outro). Assim, os ligantes são como carteiros que entregam mensagens químicas para endereços específicos em células dos vários tecidos e órgãos do corpo. O CNP não é outra coisa além de um ligante. Ele tem o seu próprio receptor na membrana celular dos condrócitos e quando se liga a este receptor chamado receptor de peptídeo natriurético B (NPR-B), inicia uma cascata de reações dentro da célula. A função natural do CNP é estimular os condrócitos a crescer. Mas, como é que ele faz isso?

Reações químicas complexas

Nós aprendemos que as proteínas e peptídeos foram criados enquanto a vida foi evoluindo (ainda está). Como as formas de vida foram se tornando mais complexas, várias destas moléculas distintas também foram se desenvolvendo, levando a funções mais complexas e assim por diante, em um ciclo virtuoso contínuo. No entanto, normalmente proteínas não têm a capacidade de decidir se é hora de trabalhar ou de deixar de trabalhar, têm uma função projetada e uma vez ligadas elas vão trabalhar sem parar. Veja, com essas moléculas reativas trabalhando sem equilíbrio, a vida não seria possível e, por isso, mecanismos de controle com base em outras proteínas, também evoluíram. Para a maioria das reações químicas do corpo existem mecanismos de controle que regulam a sua intensidade, quantidade, ritmo, frequência etc. Isto inclui, por exemplo, a forma como o FGFR3 trabalha. Em condições normais, logo após o FGFR3 ser ativado por um FGF, ele é capturado por um sistema intracelular feito de outras proteínas e é dirigido para degradação. Em outras palavras, há proteínas promotoras de reações e há proteínas para impedir que as primeiras provoquem reações. Curiosamente, esta é apenas uma forma de como é obtido o controle, ou equilíbrio, da infinidade de reações químicas. Às vezes, para uma cadeia de reações químicas que existe para uma dada finalidade, há uma outra cascata química para contrabalançá-la. Poderíamos dizer que a cascata do CNP é um exemplo dessas outras formas de controle.

Conectando com a acondroplasia

Vejamos essa figura da revisão do Dr. William Horton, publicada no Jornal GGH, em 2006. Ela mostra as cascatas do FGFR3 e do CNP no condrócito e a forma como elas interagem.

O FGFR3 é concebido para provocar uma série de reações no interior das células onde este receptor é produzido. Para a grande maioria destas células, quando ativado o FGFR3, elas reagirão aumentando a sua proliferação (multiplicação) e as taxas de maturação. A exceção notável é exatamente o condrócito: a mesma cascata de enzimas ativada pelo FGFR3 irá forçar a célula a parar de proliferar e reduzir a sua capacidade de amadurecer. É por isso que dizemos que o FGFR3 é um controlador negativo do crescimento ósseo. Em condições normais, o FGFR3 terá um tempo limitado para exercer os seus efeitos, tanto por causa dos sistemas celulares de controle acima mencionados, mas também porque há pelo menos um outro sistema reduzindo diretamente a ativação da cascata do FGFR3, o sistema do CNP. Como sabemos de tudo isso?

Mutações podem ocorrer em qualquer proteína, com as consequências mais diversas. No caso do FGFR3, se a mutação faz com que ele funcione mais ou melhor, vai prejudicar o crescimento. Estudos em camundongos mostraram que quando você abole a produção do FGFR3, a consequência é o crescimento excessivo dos ossos. No caso do sistema do CNP, se o CNP ou o seu receptor forem abolidos o indivíduo afetado terá nanismo. Pelo contrário, uma mutação no NPR-B tornando-o permanentemente ativado causa crescimento excessivo.

Se você viu a figura acima mencionada, verificou que a cascata intracelular de reações provocadas pelo CNP intercepta uma das cascatas mais importantes da via do FGFR3, a chamada quinase (ou cinase) de proteína ativada por mitógeno (MAPK). Este artigo anterior analisa a cascata do FGFR3. As enzimas MAPK são responsáveis, principalmente, por reações dentro do núcleo da célula que regulam o ritmo de maturação de condrócitos, um estágio que chamamos de hipertrofia. Nesta fase, os condrócitos saem do estágio de proliferação e começam a crescer (hipertrofiam), enquanto iniciam a produção de grandes quantidades de novos componentes da matriz da cartilagem. Se o FGFR3 está trabalhando muito, como na acondroplasia, poucos condrócitos atingem o estágio maduro e menos osso é formado. Esta é certamente uma das principais características da acondroplasia.

A cascata do CNP bloqueia a atividade das enzimas MAPK no nível de uma chamada de Raf e, portanto, reduz a influência negativa do FGFR3 na transição dos condrócitos para a fase de hipertrofia. Com mais condrócitos proliferando e atingindo a fase hipertrófica, mais osso é produzido.

Resumindo

O estudo da Biomarin mostra que, com o tratamento com o análogo do CNP BMN-111, camundongos portadores de uma mutação no FGFR3 que produz, nos animais afetados, características semelhantes as que vemos na acondroplasia, tiveram seu crescimento ósseo significativamente resgatado, apesar de que o resgate não foi completo. Os ratos tratados tiveram ossos dos membros mais longos e retos, ossos da coluna vertebral mais largos e melhor desenvolvimento dos ossos cranianos e do terço médio da face. Os estudos microscópicos revelaram que a placa de crescimento nos animais tratados era maior do que nos não-tratados, e que se assemelharam à placa de crescimento de animais normais (mas não completamente iguais). Estes resultados podem ser vistos como uma prova de conceito de que o CNP é uma estratégia válida para resgatar o crescimento ósseo em indivíduos portadores de mutações ativadoras no gene FGFR3, tal como na acondroplasia e hipocondroplasia.

Pode-se pensar que um tratamento direcionado para a forma  mais comum de nanismo parece ser somente de ordem estética. No entanto, pode-se antecipar que, apesar de uma altura final melhor ser um resultado desejado, as outras muitas melhorias que qualquer terapia dirigida contra o FGFR3 na acondroplasia podem trazer também são tão desejadas quanto. Ao reduzir as frequentes complicações ortopédicas, otorrinolaringológicas, neurológicas e sociopsicológicas, uma terapia eficaz para a acondroplasia poderia reduzir a necessidade de atendimento médico ou exposição à cirurgias difíceis, e ajudaria as amadas crianças afetadas a ter uma infância mais saudável.

Treating achondroplasia: the effects of BMN-111 in mice

Biomarin and the French group headed by Dr. Laurence Legeai-Mallet had their last paper evaluating BMN-111 in mice just published by the American Journal of Human Genetics: http://www.cell.com/AJHG/abstract/S0002-9297(12)00537-X.

What is important about this study?

This new study is important because it brings more consistent results of the tests made with the C-type natriuretic peptide (CNP) analogue in a mice model of achondroplasia.

We have already reviewed CNP in this previous article but I think that some concepts are worth to be seen again. Things may seem difficult to understand given the multitude of acronyms, expressions or jargon used in the science language. In a recent message a parent asked me to explain more the implications of this study in a more palatable way. Well, I will try.

So, let’s talk about some concepts that may help the interested but not specialist reader to understand the implications of the use of a CNP analogue in the treatment of achondroplasia.

What is CNP? What is a peptide?

CNP is a relatively small molecule called peptide and is composed by a chain of amino acids naturally built by cells of our body. It is made in the same way the proteins are: there is a gene in our DNA which encodes (carries the chemical information needed to produce) it. Try to think that CNP is a kind of a multicolored lego block chain. Proteins and peptides are quite the same thing; they will be called one way or another according to their size, peptides being smaller than proteins.

We also have learned that many proteins are called enzymes for their chemical properties. These enzymes can catalyze (trigger) chemical reactions (grossly, small electric shocks caused by the transfer of charged atoms or electrons) which in turn will generate reactions in and/or by our cells. Proteins and peptides are in fact the great masters of life, ruling all aspects of life as we know it.

Nature is smart and during the millions of years of life evolution, it made uncountable chemical experiences creating peptides and proteins with increasingly more specific properties. So, these molecules, although electrically charged, will only react with other specific molecules (or targets) that will fit with them, in the same way we combine certain lego blocks with some others but not with all of them.

This specific nature of proteins and peptides is so important that the main ones ruling the key reactions that allow life have a backbone structure very well conserved across the majority of life forms. In such proteins, depending on the species, we will find a number of switches in amino acids, some lacking, some added, but the main structure will be there, no matter the animal we study. Why are we talking about this? Well, I guess someone would ask why we are testing a mouse to see if a peptide would work in man, isn’t it? The simple reason is that CNP (or a similar molecule) is present in man and in mice and in the majority (all?) of the more advanced life forms in Earth. And more importantly: it does about the same thing in all of them. The same is valid for the fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3).

What does everything of this have with achondroplasia?

Let’s continue our short journey reviewing what these proteins and peptides do.

Proteins can act outside, across and inside the cells. We have learned here that FGFR3, a protein with electrical properties, therefore an enzyme, is placed across the cell membrane of the chondrocyte in an off mode. It works like an antenna, transmitting the outside messages to let the cell react accordingly. It is there just waiting to be turned on when connected by another… protein, which in this case is a fibroblast growth factor (FGF). When a protein or a peptide acts in such a way, starting a reaction by binding to its target, we call it a ligand (coming from Latin, meaning the one which binds to another one). Thus, ligands are no more than postmen delivering chemical messages to specific addresses in cells across the many tissues and organs of the body. CNP is no other thing than a ligand. It has its own receptor in the chondrocyte cell membrane and when it connects to this receptor called natriuretic peptide receptor B (NPR-B), it starts a cascade of reactions inside the cell. The natural function of CNP is to stimulate chondrocytes to grow. But how does it accomplish this task?

Complex chemical reactions

We have learned that proteins and peptides have been created while life was evolving (it still is). As the life forms were becoming more complex, more of these distinct molecules also developed, leading to more complex functions and so on, in a continuous virtuous cycle. However, normally proteins don’t have the capacity to decide if it is time to work or to stop working, they have that designed function and once turned on they will work non-stop. You see, with those so much reactive molecules working without balance, life would not be possible, so control mechanisms, based in other proteins have also evolved. For the majority of the chemical reactions we have in the body there are control mechanisms regulating their intensity, amount, rhythm, frequency, etc. 

This includes, for instance, the way FGFR3 works. In normal conditions, soon after FGFR3 is activated by a FGF it is captured by an intracellular system made of other proteins and is directed to degradation. In other words, there are proteins to provoke reactions and there are proteins to stop the formers to provoke reactions. Interestingly, this is just one way control, or balance, of the myriad of chemical reactions is obtained. Sometimes, for a reaction chain working for a given purpose, there is another chemical cascade counteracting it. We could say that the CNP cascade is one example of these other ways of control.

Connecting to achondroplasia

Let’s see this figure from Dr William Horton’s review published in the GGH Journal, in 2006. It shows both the FGFR3 and CNP cascades in the chondrocyte and the way they interact.

FGFR3 is designed to cause a series of reactions inside the cells this enzyme is produced. For the great majority of these cells, when FGFR3 is activated, they will react increasing their proliferation (multiplication) and maturation rates. The remarkable exception is exactly the chondrocyte: the same cascade of enzymes activated by FGFR3 will force the cell to stop proliferating and reduce its capacity to maturate. That’s why we say that FGFR3 is a negative controller of bone growth. In normal conditions, the FGFR3 will have a limited time to exert its effects, both because of the above mentioned cell control systems and also for there is at least one other system directly reducing the activation of the FGFR3 cascade, the CNP system. How do we know all of this?

Mutations can occur in any protein, with the more diverse consequences. In the case of FGFR3, if the mutation makes it works more or better, it will impair growth. Studies in mice showed that when you abolish FGFR3 production, the consequence in bones is overgrowth. In the case of the CNP system, if CNP or its receptor is abolished the affected individual will have dwarfism. On the contrary, a mutation in NPR-B turning it permanently activated causes overgrowth.

If you saw the figure mentioned above, you learned that the intracellular cascade of reactions triggered by CNP intercepts one of the most important cascades of the FGFR3 pathway, the so called mitogen-activated protein kinase (MAPK). This previous article reviews the FGFR3 cascade. The MAPK enzymes are responsible mainly for the reactions inside the cell nucleus which regulates the pace of chondrocyte maturation, a stage we call hypertrophy. In this stage chondrocytes are stopping the proliferation mode and start enlarging (hypertrophying) while producing large amounts of new components for the cartilage matrix. If FGFR3 is working too much as in achondroplasia, few chondrocytes reach the mature stage and less bone is formed. This is indeed one of the hallmarks of achondroplasia.

The CNP cascade blocks the activity of MAPK enzymes in the level of one called Raf, therefore reducing the FGFR3 negative influence on the chondrocyte transition to the hypertrophy stage. With more chondrocytes proliferating and reaching the hypertrophic stage, more bone is produced.

In summary

The study by Biomarin shows that with the CNP analogue BMN-111 treatment, mice bearing a mutation in FGFR3 that causes similar characteristics in the affected animals we see in achondroplasia, had their bone growth significantly rescued, although the rescue was not complete. The treated mice had longer and straighter limb bones, enlarged spinal bones and better development of the cranial and midface bones. The microscopic studies showed that the growth plate in those treated animals were larger than in the non-treated ones and that they closely resemble the growth plate of normal animals (but were not completely alike). These results can be seen as a proof-of-concept that CNP is a valid approach to rescue bone growth in individuals bearing activating mutations in the FGFR3 gene, such as in achondroplasia and hypocondroplasia.

One could think that a treatment directed to the most common of dwarfism would look like an esthetic one. However, we can anticipate that, even though an improved final height is a desired outcome, the other many improvements any therapy directed against FGFR3 in achondroplasia will bring are as much as desired, too. By reducing the common orthopedic, otolaryngological, neurological and sociopsychological complications, an effective therapy for achondroplasia could reduce the need for medical care or exposure to hard surgeries, and will help those affected beloved kids to have a healthier childhood.

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Enzimas de la cascada del FGFR3 pueden ser un objetivo adecuado para el tratamiento de la acondroplasia

Introducción

Un estudio publicado recientemente (1) refuerza la importancia de la vía de la cinasa de proteína activada por mitógeno (MAPK) para el crecimiento óseo. Geister y colegas, investigadores de Michigan y San Francisco, EE.UU., describen las consecuencias de una mutación recientemente identificada en el gen que codifica (realiza la instrucción bioquímica para generar) el receptor del péptido natriurético tipo C (CNP) (llamado Npr2) lo que lo convierte en inactivo.

• Geister KA et al. A novel loss-of-function mutation in Npr2 clarifies primary role in female reproduction and reveals a potential therapy for acromesomelic dysplasia, Maroteaux type. Hum Mol Gen 2012; 1–13. doi:10.1093/hmg/dds432

Los autores encontraron que el receptor del CNP incapaz conduce a un trastorno del crecimiento que se asemeja a una rara síndrome humana llamada displasia acromesomélica, tipo Maroteux.

Este síndrome se caracteriza por enanismo con huesos cortos. En resumen, se informó el efecto sobre el crecimiento óseo en ausencia de la señalización del CNP en condrocitos, y por consiguiente en la placa de crecimiento. Ahora, imagine lo que los investigadores hicieron para superar la presencia del mal funcionamiento de la señalización del CNP en sus modelos de animales. Si has pensado que han interferido en la cascada de señalización del receptor de factor de crecimiento de fibroblastos tipo 3 (FGFR3), tienes razón. Los objetivos fueron las enzimas llamadas MEK1 y MEK2 y, con el uso de inhibidores específicos, fueron capaces de recuperar el crecimiento óseo sus modelos animales.

Obviamente, también llegaran a la conclusión de que esta estrategia se puede utilizar para tratar otras condiciones en las que la ruta de MAPK es importante, tales como la acondroplasia.

La acondroplasia y el FGFR3

Siempre es bueno mejorar nuestro conocimiento sobre la biología de la acondroplasia. La acondroplasia es causada por una mutación de ganancia de función en el gen que codifica el FGFR3. En la placa de crecimiento, la función natural del FGFR3 es reducir la tasa de crecimiento, actuando conjuntamente con varios otros agentes, tales como el CNP.

Debido a la mutación, el FGFR3 está trabajando (señalizando) en exceso, causando marcada reducción de la proliferación (multiplicación) y la maduración (hipertrofia) de los condrocitos, las células responsables de la estructura de la estructura que será la base para la formación de hueso nuevo. El resultado de la señalización fuerte del FGFR3 es que el individuo afectado tendrá huesos más cortos y un canal estrecho de la columna vertebral, que a su vez darán lugar a las consecuencias clínicas comúnmente observadas en la acondroplasia. Hemos comentado este tema aquí, pero lo estamos visitando de nuevo debido a la información que estudios como el de Geister et al. y de otros investigadores traen a la luz.

El FGFR3 es una antena. Una antena que funciona con MAPK

FGFR3 es un tipo de antena celular. Se encuentra atravesado en la membrana celular de los condrocitos y actúa como un transmisor de señales del entorno para el núcleo de la célula, permitiendo a la célula responder apropiadamente a tales estímulos externos. Pero, ¿cómo FGFR3 trabaja? Como usted sabe, proteínas como el FGFR3 son moléculas orgánicas que tienen propiedades químicas que las ponen activas (y también se llaman enzimas). El FGFR3 responde a la ligación de un FGF en su parte que se encuentra fuera de la célula y, a su vez, activa una cascada de otras enzimas situadas dentro de la célula, que desencadenan una respuesta celular a través de la estimulación del núcleo para conectar o desconectar genes que codifican otras proteínas. Estas proteínas recién formadas permiten que la célula responda al estímulo producido por la unión original del FGF con el FGFR3.

FGFR3 y MAPK

Veamos con más detalle la cascada enzimática del FGFR3. La principal cascada de señalización desencadenada por el FGFR3 es la ruta de la MAPK. Mira a la siguiente figura en que se muestran las principales enzimas que intervienen en la reacción iniciada por el FGFR3.

También puede visitar otras fuentes para verificar esta cascada enzimática. Por ejemplo, la revisión por el Dr. William Horton publicada aquí (acceso gratuito) contiene una ilustración didáctica que muestra esta cascada.

En resumen, cuando dos FGFs (verde) se unen a la porción extracelular de dos FGFR3 (rojo) vecinos, se produce un acoplamiento (llamado dimerización) de las dos moléculas de FGFR3 y esta reacción causa un cambio en la posición de una parte intracelular de los receptores que a su vez, atraerá moléculas vecinas y proteínas como las FRS2a, Sos y Grb produciendo una transferencia de iones de fósforo, un fenómeno que representa la activación de enzimas. La activación de estas proteínas desencadena la activación de la cascada de enzimas de la ruta de MAPK, a continuación, comenzando con Ras, Raf, MEK y ERK y p38. La ERK y la p38 activadas se mueven al núcleo y desencadenan la activación de los genes-objetivo para provocar cambios en el comportamiento celular. Esto no es fácil de entender. Se necesita tiempo para digerir la complejidad de estas reacciones moleculares. No vamos a hablar más de estos detalles químicos.

El CNP actúa inhibiendo la vía MAPK. Podríamos hacer lo mismo?

El CNP actúa bloqueando la señalización producida por la proteína Raf. Visita la revisión del Dr. Horton y mira la figura que muestra la cascada del FGFR3. También se muestra la interacción del CNP y la cascada de MAPK. Mediante la reducción de la actividad de la cascada de MAPK, el CNP restaura el crecimiento óseo. Podemos hacer lo mismo con compuestos sintéticos? Se puede bloquear la vía MAPK? La respuesta es sí. El problema principal aquí es que las enzimas MAPK juegan un papel clave en reacciones celulares en todos los tejidos del cuerpo, y parece demasiado arriesgado bloquear una de estas moléculas para el crecimiento óseo.

Pero esto no es exactamente lo que hace el CNP? Él está presente en todos los tejidos del cuerpo cuando se inyectan en animales de ensayo descritos en los estudios publicados?

La razón por la cual está siendo un análogo de CNP buscado para convertirse en una terapia para la acondroplasia es que se ha demostrado que este péptido tiene importancia biológica específicamente y casi sólo a la placa de crecimiento. Sin embargo, ¿para un compuesto fabricado diseñado para bloquear, por ejemplo, las enzimas MEK, como se puede hacerlo que sólo los MEKs producido por los condrocitos en la placa de crecimiento sean bloqueados?

Imagine que se traga una pastilla que contiene el inhibidor de MEK que se absorbe después en el intestino. ¿Como este compuesto anti-MEK "sabe" que no debe bloquear las MEKs producidas en las células intestinales? Fármacos clásicos por lo general no tienen GPS para ayudarles a encontrar el camino, no saben lo que es la célula-objetivo correcta.

Hay varios anti-Raf, anti-MEK y anti-ERK ya en el mercado o en desarrollo para tratar una variedad de condiciones, más en particular el cáncer (2). Algunos, como vemurafenib (enlace en Inglés), un anti-Raf (un Raf mutado), ya se está utilizando para tratar el melanoma.

Cuando la enfermedad a tratar es un cáncer devastador, hay menos preocupación sobre los efectos secundarios potenciales, los llamados efectos fuera-de-objetivo. Sin embargo, generalmente para condiciones no malignas y crónicas, y otros trastornos a largo plazo, debe hacerse un juicio equilibrado. Si el fármaco produce muchos efectos secundarios potencialmente peligrosos, puede ser que no vale la pena investigar sobre su uso para estas condiciones.

Medicamentos para la placa de crecimiento necesitan GPS

Por eso, aunque hay varios medicamentos cuyos objetivos son la cascada de MAPK, que no vemos investigación dirigida a examinar la posibilidad de usarlos para tratar la acondroplasia. Es pesado y "lleno de riesgo" el gasto de recursos para encontrar un buen GPS para estos medicamentos. Pues bien, la placa de crecimiento no es exactamente Times Square o la Torre Eiffel, se parece más a una aldea remota de la selva amazónica, donde se necesita mapas, GPS y equipo para encontrarla. También ya revisamos este tema en este artículo anterior.

Comentarios

Después de todo, la buena noticia de estudios como éste de Geister y sus colegas, es el hecho de que se han publicando más y más evidencia acerca del concepto de bloqueo de la MAPK para tratar la acondroplasia.

Este artículo también refuerza la idea de que la vía MAPK, y especialmente la enzima ERK y sus objetivos en el núcleo de los condrocitos parecen ser esenciales para el crecimiento del hueso.

Como mencioné en un artículo reciente, estamos llegando a un punto en que ya no se preguntará si hay terapia para la acondroplasia, se preguntará cual la que usaremos para tratar a nuestros hijos.

Referencias

1. Geister KA et al. A novel loss-of-function mutation in Npr2 clarifies primary role in female reproduction and reveals a potential therapy for acromesomelic dysplasia, Maroteaux type. Hum Mol Gen 2012; 1–13. doi:10.1093/hmg/dds432.

2. Santarpia L et al. Targeting the MAPK-RAS-RAF signaling pathway in cancer therapy. Expert Opin Ther Targets 2012;16(1):103-119. (acceso gratuito).

Traducción: Google translator, con revisión del autor.

Enzimas da cascata do FGFR3 podem ser alvos apropriados para o tratamento da acondroplasia

Introdução

Um estudo publicado recentemente (1) reforça a importância da via da quinase da proteína ativada por mitógeno (MAPK) para o crescimento ósseo. Geister e colaboradores, pesquisadores de Michigan e San Francisco, EUA, descreveram as consequências de uma mutação recém-identificada no gene que codifica (contem a instrução bioquímica para gerar) o receptor do peptídeo natriurético tipo C (CNP) (chamado de Npr2), que torna este peptídeo inativo.

Os autores descobriram que o mau funcionamento do receptor do CNP levou a um distúrbio de crescimento que se assemelha a uma síndrome humana rara chamada displasia acromesomélica, tipo Maroteux.

• Geister KA et al. A novel loss-of-function mutation in Npr2 clarifies primary role in female reproduction and reveals a potential therapy for acromesomelic dysplasia, Maroteaux type. Hum Mol Gen 2012; 1–13. doi:10.1093/hmg/dds432

Esta síndrome é caracterizada por nanismo com ossos curtos. Em resumo, eles descreveram o efeito no crescimento ósseo da falta da sinalização do CNP nos condrócitos e, consequentemente, na placa de crescimento. Agora, adivinhe o que eles fizeram para superar a presença do mau funcionamento da sinalização do CNP em seus modelos de animais. Se você pensou que eles miraram na cascata de sinalização do receptor do fator de crescimento de fibroblastos tipo 3 (FGFR3), acertou. Os alvos foram as enzimas chamadas MEK1 e MEK2 e, com o uso de inibidores específicos contra essas enzimas, eles foram capazes de resgatar o crescimento ósseo de seus modelos animais. 

Obviamente, concluíram deduzindo que esta estratégia pode ser usada para tratar outras condições em que a via MAPK é importante, tais como a acondroplasia.

Acondroplasia e o FGFR3

É sempre bom reforçar o nosso conhecimento sobre a biologia da acondroplasia. A acondroplasia é causada por uma mutação de ganho-de-função no gene que codifica o FGFR3. Na placa de crescimento, a função natural do FGFR3 é reduzir o ritmo de crescimento, atuando em concerto com diversos outros agentes, tais como o CNP. 

Devido à mutação, o FGFR3 está trabalhando (sinalizando) excessivamente, o que provoca uma redução acentuada da proliferação (multiplicação) e maturação (hipertrofia) dos condrócitos, as células responsáveis ​​pela construção da estrutura que será a base para a formação de osso novo. O resultado da sinalização excessiva do FGFR3 é que o indivíduo afetado terá ossos mais curtos e um canal espinhal mais estreito na coluna vertebral, alterações as quais, por sua vez irão conduzir às consequências clínicas comuns observadas na acondroplasia. Já comentamos este assunto aqui, mas o estamos visitando novamente por causa das informações que estudos como o de Geister et al. e de outros investigadores estão trazendo à luz.

FGFR3 é uma antena. Uma antena que funciona usando MAPK

O FGFR3 é um tipo de antena celular. Ele está localizado atravessado na membrana celular dos condrócitos e funciona como um transmissor de sinais do ambiente para o núcleo da célula, para permitir que a célula responda adequadamente a tais estímulos externos. 

Mas, como o FGFR3 trabalha? Como você sabe, proteínas como o FGFR3 são moléculas que têm propriedades químicas ativas (e também são chamados de enzimas). O FGFR3 reage a partir de uma ligação de um FGF em sua parte que fica fora da célula. Quando ocorre essa ligação dizemos que o receptor foi ativado. A ativação do receptor desencadeia uma reação em cadeia dentro da célula, uma cascata de ativação de outras enzimas, o que irá desencadear uma resposta celular através da estimulação do núcleo para ligar ou desligar os genes que codificam outras proteínas. Estas proteínas recém-formadas permitirão que a célula responda ao estímulo original produzido pela ligação do FGF com o FGFR3.

FGFR3 e MAPK

Vamos ver com mais detalhes a cascata enzimática do FGFR3. A cascata de sinalização principal desencadeada pelo FGFR3 é a via MAPK. Veja a figura a seguir, que mostra as principais enzimas envolvidas na reação iniciada pelo FGFR3.

Você também pode visitar outras fontes para verificar essa cascata enzimática. Por exemplo, a revisão pelo Dr. William Horton publicada aqui (acesso livre) contém uma figura didática mostrando esta cascata.

Em resumo, quando FGFs (verde) se ligam à parte extracelular de dois FGFR3 (vermelho) próximos, ocorre um acoplamento (chamamos de dimerização) das duas moléculas de FGFR3 e esta reação provoca uma mudança na posição de algumas partes intracelulares dos receptores o que, por sua vez, irá atrair moléculas vizinhas e proteínas como FRS2a, Sos e Grb, produzindo a transferência de íons de fósforo, um fenómeno que representa a ativação das enzimas. A ativação dessas proteínas desencadeia a ativação da cascata de enzimas da via MAPK, começando por Ras e então, Raf, MEK e ERK e p38. A ERK e p38 ativadas deslocam-se para o núcleo e desencadeiam a ativação de genes alvo para causar alterações no comportamento celular. Isso não é fácil de entender. É preciso tempo para digerir a complexidade dessas reações moleculares e por isso paramos por aqui sobre esses detalhes químicos.

O CNP atua inibindo a via MAPK. Poderíamos fazer o mesmo?

O CNP funciona bloqueando a sinalização produzida pela proteína Raf. Visite a revisão do Dr. Horton e veja a figura apresentando a cascata do FGFR3. Ela também mostra a interação do CNP com a cascata MAPK. Ao reduzir a atividade da cascata MAPK, o CNP restaura o crescimento ósseo. Podemos fazer o mesmo usando compostos sintéticos? Podemos bloquear a via MAPK? A resposta é sim. O principal problema aqui é que as enzimas MAPK têm papel chave em reações celulares em todos os tecidos do corpo, e parece excessivamente arriscado bloquear uma dessas moléculas para obter crescimento ósseo.

Mas, não é exatamente isso o que faz o CNP? Ele atua em todos os tecidos do corpo quando injetado em animais de teste descritos nos estudos publicados?

A razão pela qual um análogo do CNP está sendo pesquisado para se tornar uma terapia para a acondroplasia é que tem sido demonstrado que este peptídeo apresenta importância biológica especificamente e quase somente na placa de crescimento. No entanto, para um composto manufaturado concebido para bloquear, por exemplo, as enzimas MEK, como podemos fazê-lo bloquear apenas as MEKs produzidas pelos condrócitos na placa de crescimento?

Imagine isto: uma pílula que contém o inibidor de enzimas MEK é engolida e então absorvida no intestino. Como este composto anti-MEK "sabe" que não deve bloquear as MEKs produzidos nas células intestinais? Drogas clássicas geralmente não têm GPS para ajudá-las a encontrar o caminho, não sabem qual é a célula-alvo correta.

Existem vários compostos anti-Raf, anti-MEK e anti-ERK já no mercado ou em desenvolvimento para tratar uma série de condições, notadamente câncer (2). Alguns, como o vemurafenib (em inglês), um anti-Raf, já está sendo usado para tratar o melanoma.

Quando a doença a ser tratada é uma como este tipo de câncer devastador, há menos preocupação com potenciais efeitos colaterais, ou os chamados efeitos fora do alvo. Mas para condições não malignas, geralmente crônicas, e outras desordens de longo prazo, um julgamento equilibrado deve ser realizado. Se a droga produz muitos eventos adversos potencialmente perigosos, pode não valer a pena prosseguir na pesquisa na sua utilização para essas condições.

Medicamentos para a placa de crescimento precisam de GPS

É por isso que, embora existam várias drogas cujos alvos são a cascata MAPK, não vemos pesquisas direcionadas a analisar a possibilidade de tratar a acondroplasia com elas. É difícil e "arriscado" gastar recursos tentando encontrar um bom GPS para esses medicamentos. Bem, a placa de crescimento não é exatamente Times Square ou a Torre Eiffel, é mais como uma aldeia remota na floresta amazônica, onde você precisa de mapas, equipamentos e GPS para encontrá-la. Também revisamos este tema neste artigo anterior.

Comentários

Afinal, a boa notícia que estudos como este de Geister e colaboradores trazem, é o fato de que mais e mais evidências sobre o conceito de bloquear a MAPK para tratar a acondroplasia estão sendo publicadas.

Este artigo também reforça a ideia de que a via MAPK, e, especialmente, a enzima ERK e os seus alvos no núcleo dos condrócitos parecem ser essenciais para o crescimento do osso.

Como mencionei em um artigo recente, estamos chegando a um momento em que não estaremos mais perguntando se haverá uma terapia para a acondroplasia, perguntaremos qual vamos usar para tratar os nossos filhos.

References

1. Geister KA et al. A novel loss-of-function mutation in Npr2 clarifies primary role in female reproduction and reveals a potential therapy for acromesomelic dysplasia, Maroteaux type. Hum Mol Gen 2012; 1–13. doi:10.1093/hmg/dds432.

2. Santarpia L et al. Targeting the MAPK-RAS-RAF signaling pathway in cancer therapy. Expert Opin Ther Targets 2012;16(1):103-119. (free access).

Enzymes of the FGFR3 cascade may be appropriate targets for the treatment of achondroplasia

Introduction

A recently published study (1), reinforces the importance of the Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) cascade for bone growth. Geister and coworkers, researchers from Michigan and San Francisco, US, described the consequences of a newly identified mutation in the gene that encodes (carry the biochemical instruction to generate) the C-type natriuretic peptide (CNP) receptor (Npr2) which makes it inactive.

This syndrome is characterized by short bone dwarfism. In summary, they described the effect in bone growth of the lack of CNP signaling in the chondrocytes and, consequently, in the growth plate. Now, guess what they did to overcome the presence of a malfunctioning CNP signaling in their animal models. If you thought on targeting the fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) cascade, you are right. They targeted the enzymes called MEK1 and MEK2 and, using specific inhibitors, they were able to rescue bone growth of their animal models. Obviously, they concluded by implying that this strategy could be used to treat other conditions where the MAPK pathway is important, such as achondroplasia.

You can also visit other sources to check this enzymatic cascade. For instance, the review by Dr. William Horton published here (free access) contains a nice figure showing this cascade.

In summary, when a FGF (green) bind to the extracellular part of the FGFR3 (red) it will produce the coupling (we call dimerization) of two FGFR3 molecules and this reaction causes a change in the position of some intracellular parts of the receptors, which in turn, will attract neighbor molecules and proteins like FRS2a, Sos and Grb, causing the transference of phosphorus ions, a phenomenon that represents the activation of the enzymes. The activation of these proteins triggers the cascade activation of enzymes of the MAPK pathway starting by Ras, Raf, MEK and ERK and p38. The activated ERK and p38 translocate (move) to the nucleus and trigger the activation of target genes to cause changes in cell behavior. This is not easy to copy. It needs time to digest the complexity of these molecular reactions. We will not go further on the chemistry details.


The authors found that the malfunctioning of the CNP receptor leaded to a growth disturbance which resembles a rare human syndrome called acromesomelic dysplasia, Maroteux type.

Achondroplasia and the FGFR3 

It is always good to strengthen our knowledge about the biology of achondroplasia. Achondroplasia is caused by a gain-in-function mutation in the gene that encodes the FGFR3. In the growth plate, the natural function of FGFR3 is to reduce the growth pace, acting in concert with several other agents, such as CNP. Because of the mutation, FGFR3 is working (signaling) excessively and this causes marked reduction of the proliferation (multiplication) and maturation (hypertrophy) of the chondrocytes, the cells responsible for building the scaffold which will give base for the new forming bone. The result of the strong FGFR3 signaling is that the affected individual will have shorter bones and a narrow spinal canal, which in turn will lead to the common clinical consequences seen in achondroplasia. We have already reviewed this topic here, but we are visiting this again because of the insights studies like the one by Geister et al. and from other investigators are bringing to light.

FGFR3 is an antenna. An antenna which works using MAPK

FGFR3 is a kind of cell antenna. It is located across the chondrocyte cell membrane and works as a transmitter of environmental signals to the cell nucleus, to allow the cell to respond appropriately to those external stimuli. But how does FGFR3 work? As you know, proteins like FGFR3 are organic molecules which have active chemical properties (and are also called enzymes). FGFR3 reacts to the binding of an FGF coming from outside the cell and, in turn, activates a cascade of other enzymes located inside the cell, which will trigger a cell response by stimulating the nucleus to turn on or off genes encoding other proteins. These newly formed proteins will allow the cell to respond to the original stimulus produced by that binding of the FGF to FGFR3. 

FGFR3 and MAPK 

Let’s see in more detail the FGFR3 enzymatic cascade. The main signaling cascade triggered by FGFR3 is the MAPK pathway. Take a look in the following figure showing the main enzymes involved in the reaction started by FGFR3.

CNP acts inhibiting the MAPK pathway. Could we do the same with other compounds?

CNP works blocking the signaling produced by Raf. Visit Dr. Horton’s review and take a look in the figure presenting the FGFR3 pathway. It is also showing the interaction of CNP and the MAPK cascade. Reducing the activity of the MAPK cascade, CNP restores bone growth. Can we do the same using synthetic compounds? Can we block the MAPK pathway? The answer is yes. The main issue here is that the MAPK enzymes are key players in so many cell reactions in all body tissues that it seems excessively risky to block one of those molecules to obtain bone growth.

But, isn't this exactly what CNP does? Is it working in all tissues of the body when injected in the test animals described in the published studies?

The reason why a CNP analogue is being developed to become a therapy for achondroplasia is that this peptide has been showing to have its main biological relevance specifically and almost only in the growth plate. However, for a manufactured compound designed to block, for instance, the enzymes MEK, how could we make it to only block MEKs produced by chondrocytes in the growth plate?

Imagine this: a pill containing the MEK inhibitor is swallowed and then absorbed in the intestines. How would this anti-MEK compound “know” it shouldn’t block the MEKs produced in the intestinal cells? Man-made classical drugs usually don’t have GPS to help them find the way; they don’t know which the right target cell is.

There are several anti- Raf, anti-MEK and anti-ERK compounds already in the market or being developed to treat a number of conditions, notably cancer (2). Some, like vemurafenib, an anti-Raf (a mutated Raf), is already being used to treat melanoma.

When the disease to be treated is one such as this kind of devastating cancer, there is less concern about potential side effects, what is called off-target effects. But for non-malignant conditions, usually chronic, long term disorders, a more balanced approach must be taken. If the drug causes so many potential dangerous adverse events, it is not worth to pursue its use for that condition.

Drugs for the growth plate need GPS

That’s why although there are several drugs targeting the MAPK cascade we do not see research directed to examine the possibility of treating achondroplasia with them. It is difficult and “risky” to expend resources trying to find a good GPS for these drugs. You know, the growth plate is not exactly Times Square or the Eiffel Tower, it is more like a remote village in the Amazon forest, where you will need maps, equipment and GPS to find it. We have also reviewed this topic in this previous article.

Comments

Nevertheless, the good news studies like this one by Geister and coworkers bring is that more and more evidence about the concept of blocking the MAPK to treat achondroplasia is being published. 

This article is also reinforcing that the MAPK pathway, and especially the ERK enzyme and its targets in the chondrocyte nucleus seem to be key for bone growth.

As I mentioned in a recent article, we are reaching a time when we will be asking no more about the existence of a therapy for achondroplasia; we will be asking which one we will use to treat our children. 

References

1. Geister KA et al. A novel loss-of-function mutation in Npr2 clarifies primary role in female reproduction and reveals a potential therapy for acromesomelic dysplasia, Maroteaux type. Hum Mol Gen 2012; 1–13. doi:10.1093/hmg/dds432

2. Santarpia L et al. Targeting the MAPK--RAS—RAF signaling pathway in cancer therapy. Expert Opin Ther Targets 2012;16(1):103-119. Free access