¿Por qué los condrocitos se detienen en la acondroplasia?

Traducción: Maria Cristina Terceros

Introducción

El objetivo de este artículo es revisitar el origen de la acondroplasia, a partir de una nueva perspectiva, inspirada por un artículo muy interesante del Dr. Pavel Krejci, un entusiasmado investigador de la biología del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR3) y un fuerte aliado de la investigación sobre la acondroplasia, publicado apenas unas semanas atrás. (1) Este texto intenta explicar la hipótesis formulada por el Dr. Krejci para explicar la acondroplasia.

Esta breve revisión también nos ayudará a presentar el próximo artículo planificado para el blog, cuyo tema será sobre el efecto del bloqueo de la cascada enzimática debatida aquí. Sé que los 17 lectores originales del blog podrán ver este texto como algo repetitivo, pero, mientras adquirimos más conocimiento sobre la acondroplasia, siempre incluimos un nuevo detalle.

La vida es eléctrica

La vida funciona con electricidad. Cada momento de un ser vivo es gobernado por reacciones químicas coordenadas, a partir de transferencias de cargas eléctricas. Si pensamos por un instante que en el cuerpo existen millares y millares de moléculas que participan de este programa químico coordinado, podemos comenzar a entender cómo la vida es compleja. ¿Consigues imaginarte el tipo de “software” que se necesita para controlar esta máquina increíble? Un programa principal para controlar la máquina de la vida necesita ser bastante robusto y fuerte.

Sin embargo, al mismo tiempo en que la vida es dirigida por un programa increíblemente fuerte, ella también es demasiado frágil. Con miles de millones de reacciones químicas (eléctricas) que se dan en el cuerpo en apenas un día, los errores tienden a aparecer. Es necesario apenas un error no identificado en la construcción de una nueva molécula en el interior de la máquina para que el equilibrio pueda ser quebrado, llevando al cuerpo de un estado saludable a la enfermedad. Un bug en el software y las consecuencias pueden ser graves para la máquina.

A pesar de eso, la máquina tiene su propio software de control de calidad que funciona junto con el principal y, por eso, cuando las cosas salen mal, el software guardián es activado y la gran mayoría de los errores es corregida bastante rápidamente. En una célula, si el software de control de calidad detecta un error y no puede corregirlo, otras medidas de control son iniciadas, y la célula puede determinar su propia muerte o encaminarse hacia un estado de parálisis llamado senescencia celular (2,3) (vamos a recordar esto más tarde).

Proteínas, interruptores eléctricos

En el cuerpo, los maestros de las reacciones químicas (eléctricas) que conducen la vida, son moléculas a las cuales denominamos proteínas. Las proteínas son grandes estructuras hechas de otras más pequeñas, conocidas como aminoácidos. Si bien muchos aminoácidos existen en la naturaleza, hay un número limitado de ellos que son considerados esenciales para la vida. Todas las proteínas presentes en el cuerpo son hechas de los mismos aminoácidos y son sus combinaciones específicas, codificadas dentro del ADN, las que crearán las diferentes proteínas funcionales. Combinaciones correctas de aminoácidos son fundamentales, ya que cada uno tiene sus propias propiedades eléctricas. Entonces, podrás notar aquí que si una proteína lleva reacciones eléctricas de cierta manera debido a su conformación (posición en la cadena de aminoácidos), entonces imagina lo que puede suceder cuando la conformación está equivocada. Un aminoácido mal colocado y la proteína puede inactivarse o más bien activarse demasiado.

A pesar de que son los maestros de la vida, no todas las proteínas realizan reacciones químicas y, cuando lo hacen, son denominadas enzimas. Podemos pensar en enzimas como interruptores químicos (eléctricos) de pared. Sus actividades permiten que el cuerpo funcione correctamente y reaccione bastante rápidamente, ante los estímulos internos y externos.

Figura 1. Las proteínas son como interruptores eléctricos 

Manutenção & Suprimentos 

Normalmente, las enzimas no funcionan solas. Por el contrario, en la mayoría de las veces ellas actúan conjuntamente con otras, de una manera que podríamos compararlas con los bloques de una cadena de dominó, donde el primer bloque llega al siguiente, y éste llega a un tercero, para causar un efecto al final de la línea. En el caso de las enzimas, la reacción química, o la señal, hará con que la célula que la está recibiendo se comporte de una manera apropiada para responder a la causa de la señal.

Figura 2. Una cascada de enzimas es como un efecto dominó 

Wikimedia commons

Una señal química puede comenzar como una respuesta al tiempo afuera, o en una estación de esquí o en la playa. Esté el tiempo frío o caliente, el cuerpo responderá para equilibrar la temperatura interna con la del medio ambiente, por medio de cientos de reacciones químicas en muchos tejidos y órganos. Como mencionado anteriormente, si todas las señales se encuentran bajo control, el cuerpo responderá de manera adecuada, de otra manera, habrá problemas más adelante.

Entendiendo la acondroplasia

Todos esos conceptos son importantes, porque nos pueden ayudar a comprender que sucede en condiciones clínicas como la acondroplasia. En la acondroplasia, una de esas proteínas activas, el FGFR3 (Figura 3) contiene una modificación en su estructura, una mutación, que hace con que sea más activa que lo habitual. Si el error de construcción del FGFR3 se diese en un cuerpo adulto, probablemente el software de control de calidad podría verlo y resolverlo, caso contrario el error podría conducir al cáncer (ver abajo).

Sin embargo, como en la acondroplasia el error es innato (lo que es llamado en la jerga técnica de mutación germinativa), la mutación no sería reconocida como un error por el control de calidad, ya que está en el código del ADN desde el principio. Si un error está causando muchos problemas desde el principio, la nueva forma de vida que se está desarrollando (el embrión) no será bien sucedida, no tendrá un buen final. En la acondroplasia, el FGFR3 alterado ejerce una influencia indebida desde el principio, que perjudica el crecimiento óseo ya desde el útero, pero con una intensidad que usualmente no amenaza la vida. Sin embargo, con una enzima receptora “trabajólica” (workaholic) en la máquina, el programa de desarrollo del nuevo ser tendrá dificultades (ver a continuación).

Figura 3. Un modelo estructural de FGFR3

LLNL Biosciences

Señales químicas llevan a la acondroplasia

Después del nacimiento, el FGFR3 es producido casi de manera exclusiva, o sea, de manera relevante, por células llamadas condrocitos, las cuales viven dentro de una región bastante especializada en las extremidades de los huesos largos, la placa de crecimiento cartilaginosa.

La función normal del FGFR3 es ayudar a los condrocitos a controlar su propia velocidad de proliferación (multiplicación) y maduración. Si el FGFR3 está ausente, los huesos crecen excesivamente y las consecuencias dañinas también surgen. (4) Por lo tanto, en condiciones normales, el FGFR3 es un freno importante para el crecimiento natural de los condrocitos. Sin embargo, una vez que en la acondroplasia el FGFR3 está señalizando excesivamente, el resultado es que los condrocitos simplemente paran de proliferar y madurar, lo que causa una detención del crecimiento óseo en general y las características clínicas de esta condrodisplasia.

Mencionamos que las enzimas no trabajan solas, y el FGFR3 no es una excepción. Él está asociado a una serie de cascadas de enzimas para ejercer sus funciones (Figura 4) y nosotros visitaremos nuevamente una de ellas, la de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK), que fue la explorada por el estudio que veremos en el próximo artículo del blog.

La cascada MAPK

En los últimos años, un número creciente de evidencias ha sido publicado enfocándose en la cascada enzimática MAPK como el probable principal motor de la detención del crecimiento óseo visto en la acondroplasia. (5)

Figura 4. Cascadas de señalización del FGFR3 

Por ejemplo, varios estudios que exploran el péptido natriurético tipo C (CNP) contribuyeron mucho para la comprensión de cómo la señalización de la MAPK perjudica el crecimiento óseo. (6-9) Esto, a su vez, dio como resultado el desarrollo de la primera terapia farmacológica en potencial para la acondroplasia, el análogo del CNP BMN-111 (10), actualmente listo para ingresar en la fase 2 de su desarrollo clínico. Para saber más sobre la evolución clínica de un nuevo medicamento en potencial podes visitar este artículo anterior del blog.

El FGFR3 es una antena química

La cascada MAPK está representada en la figura 4 de modo bastante simplificado. En resumen, el FGFR3 es denominado enzima receptora (o técnicamente, una tirosina-quinasa receptora) porque él está situado cruzando la membrana celular (la capa) del condrocito (Figura 3), como una antena sobre el tejado de un edificio, esperando señales de TV. El estado natural del FGFR3 está inactivo (o apagado). Ya revisé este tema en otros artículos de este blog.
 
Figura 5. FGFR3, una antena en el tejado de la célula

Wikimedia commons

El FGFR3, como una antena de TV lista para recibir apenas ondas de TV, aceptará estímulos específicos solamente de proteínas FGFs. Cuando un FGF se une al FGFR3, el receptor se activa (se enciende), lo que causa una alteración en el cuerpo del FGFR3, el cual a su vez generará una carga eléctrica, la señal, la cual es producida a través del dislocamiento de algunos iones de fósforo (un fenómeno llamado fosforilación) en la parte del receptor que está en el interior de la célula.
 
Esta señal eléctrica/química será llevada a otras moléculas vecinas y, al viajar de una a otra, como en la cadena del dominó, la señal llegará a la primera enzima de la cascada de la MAPK, que es denominada como Ras. La Ras es activada (encendida) y activará la enzima siguiente en la vía, denominada RAF, que activará entonces a la MEK, que a su vez transfiere la señal para otra enzima denominada ERK. La ERK es el mensajero que llevará la señal traída por el FGF desde fuera hacia el núcleo de la célula, donde el programa celular reaccionará de acuerdo con la señal recibida (Figura 3).

Sugiero que veas el siguiente video (14 min), el cual muestra una animación rica y detallada de una cascada de señalización en acción, con la correspondiente respuesta de la célula. Las células pueden responder a señales externas produciendo nuevas proteínas y la animación muestra este proceso.

Animación. Cascada de señalización enzimática y el proceso de transcripción del ADN. 

DNA Learning Center by Cold Spring Harbor Laboratory

La cascada de señalización MAPK en condrocitos

La MAPK es un factor-clave de funciones celulares importantes en todos los tejidos del cuerpo. Esto implica que la MAPK responde a un gran número de antenas celulares, no solamente al FGFR3 (visite este artículo en inglés en la Wikipedia para ver la figura que muestra las interacciones conocidas de la MAPK).

Normalmente, la MAPK funciona como un gatillo de crecimiento: las células estimuladas vía MAPK comienzan a multiplicarse y sobreviven por más tiempo. Esta propiedad es fácilmente reconocida por células cancerosas, las cuales frecuentemente usan a la MAPK para multiplicarse más rápidamente. No es de extrañar que, últimamente, hayamos visto el desarrollo de varios nuevos compuestos enfocando enzimas de la cascada MAPK para tratar varios tipos de cáncer (revisado aquí).

Sin embargo, como acabamos de mencionar anteriormente, los condrocitos reaccionan ante la MAPK exactamente en el sentido opuesto, y reducen su ritmo de crecimiento cuando están bajo influencia de la señalización de la MAPK. (11) ¿Cómo sucede esto? La hipótesis del Dr. Pavel Krejci puede responder a esta pregunta. (1)

En su análisis, él postula que este comportamiento de los condrocitos sería una reacción natural a lo que ellos reconocen como una señal equivocada que viene del FGFR3 mutante. En otras palabras, debido a la superactividad del FGFR3 que produce un exceso de estímulo en el crecimiento de los condrocitos de la placa de crecimiento, estas células se defienden entrando en un modo de pausa, la senescencia celular mencionada anteriormente. Ellas apagan la electricidad.

¿Recuerdas lo que mencionamos al inicio de este artículo, que existe un programa de control de calidad que funciona con el programa principal, ejecutando en la máquina (en el cuerpo), para garantizar que las reacciones químicas estén yendo por el camino correcto? De este modo, la hipótesis del Dr. Krejci puede ser una buena explicación para el comportamiento excepcional de los condrocitos que enfrentan un exceso de actividad del FGFR3. La célula podrá no ver al FGFR3 mutante como un tema, pero consigue darse cuenta de que algo anda mal con la excesiva señalización de la MAPK.

Por lo tanto, la acondroplasia sería la consecuencia final de los condrocitos al “diagnosticar” la señalización excesiva de la MAPK como un problema, encendiendo así el software de control de calidad para entrar en una especie de modo de pausa, con el propósito de protegerse del potencial daño que puede ocurrir ante el excesivo estímulo al crecimiento, que sabemos que es común en el cáncer. Ellos se mantienen con las funciones celulares básicas, pero detienen el programa esencial de proliferación para el crecimiento óseo. El resultado son huesos cortos, un estrecho canal en la columna vertebral y las consecuencias clínicas de la acondroplasia.

FGFR3 y MAPK en células óseas

Una vez que hay evidencias de que el FGFR3 hiperactivo también provoca alteraciones en células del hueso (osteoblastos), también es útil ver lo que sucede con esas células bajo la influencia de la vía FGFR-MAPK. Contamos con informaciones a ese respecto, por ejemplo, que vienen de un estudio realizado por el grupo del Dr. Sunichi Murakami. En uno de sus recientes trabajos, explotaron la inhibición del FGFR3 y de la MEK en osteoblastos in vitro y in vivo, y concluyeron que la vía de la MAPK es también muy importante para la salud de los huesos. (12)

Conclusión

Una pregunta que podemos hacer sobre la hipótesis del Dr. Krejci está relacionada con el propio mecanismo de acción del FGFR3. Si el FGFR3 es un freno natural para el crecimiento óseo, y actúa naturalmente a través de la cascada MAPK, ¿por qué motivo los condrocitos usarían como recurso del proceso de senescencia, ya que la señal esencial ("pare de crecer") no cambió? Puede ser que lo que activa el proceso de senescencia sea un “nivel” interno de actividad de la vía MAPK, que cuando es cruzado, activa el proceso de detención, pero el mecanismo por el cual esto sucedería es lo que todavía no está claro.

Aprovechando el debate sobre la acción de la MAPK, en el próximo artículo analizaremos otro estudio, donde investigadores testearán un par de moléculas creadas para inhibir a la MAPK en el cáncer. Lo que es relevante en su trabajo es que ellos exploraron estos componentes en el hueso y en la placa de crecimiento, con consecuentes implicaciones para diferentes estrategias de desarrollo en el tratamiento de la acondroplasia.

Referencias 

1. Krejci P. The paradox of FGFR3 signaling in skeletal dysplasia: why chondrocytes growth arrest while other cells over proliferate. Mut Res 2013; http://dx.doi.org/10.1016/j.mrrev.2013.11.001.

2. Campisi J & Fagagna FA. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Rev Mol Cell Biol 2007;8:729-40.

3. Campisi J. Cell biology: the beginning of the end. Nature 2013; doi:10.1038/nature12844. Published online 18 December 2013.

4. Toydemir RM et al. Novel mutation in FGFR3 causes camptodactyly, tall stature, and hearing loss (CATSHL) Syndrome. Am J Hum Genet 2006;79(5):935-41. Acceso libre

5. Foldynova-Trantirkova S et al. Sixteen years and counting: the current understanding of
fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) signaling in skeletal dysplasias. Hum Mutat 2012; 33:29–41. Acceso libre

6. Krejci P et al. Interaction of fibroblast growth factor and C-natriuretic peptide signaling in regulation of chondrocyte proliferation and extracellular matrix homeostasis. J Cell Sci 2006; 118: 5089-00. Acceso libre

7. Nakao K et al. Impact of local CNP/GC-B system in growth plates on endochondral bone growth. Pharmacol Toxicol 2013; 14 (Suppl 1):48. Acceso libre

8. Yasoda A et al. Systemic Administration of C-Type Natriuretic Peptide as a Novel Therapeutic Strategy for Skeletal Dysplasias. Endocrinology 2009;150: 3138–44.

9. Yasoda A and Nakao K. Translational research of C-type natriuretic peptide (CNP) into skeletal dysplasias. Endocrine J 2010; 57 (8): 659-66. Acceso libre
 
10. Lorget F et al. Evaluation of the therapeutic potential of a CNP analog in a Fgfr3 mouse model recapitulating achondroplasia. Am J Hum Genet 2012;91(6):1108-14. Acceso libre
 
11. Murakami S et al. Constitutive activation of MEK1 in chondrocytes causes Stat1-independent achondroplasia-like dwarfism and rescues the Fgfr3-deficient mouse phenotype. Genes Dev 2004;18(3):290-305. Acceso libre
 
12. Kyono A et al. FGF and ERK signaling coordinately regulate mineralization-related genes and play essential roles in osteocyte differentiation. J Bone Miner Metab 2012;30(1):19-30. Acceso libre

Por que os condrócitos param na acondroplasia ?

Introdução

O objetivo deste artigo é revisitar a origem da acondroplasia a partir de uma nova perspectiva, inspirada por um artigo muito interessante do Dr. Pavel Krejci, um entusiasmado pesquisador da biologia do receptor do fator de crescimento de fibroblastos 3 (FGFR3) e um forte aliado da pesquisa da acondroplasia, publicado apenas algumas semanas atrás. (1) Este texto busca interpretar a hipótese formulada pelo Dr. Krejci para explicar a acondroplasia.

Esta breve revisão irá também nos ajudar a introduzir o próximo artigo planejado para o blog, que é sobre o efeito do bloqueio da cascata enzimática discutida aqui. Sei que os 17 leitores originais do blog podem achar este texto um pouco repetitivo mas, enquanto adquirimos mais conhecimento sobre a acondroplasia, sempre incluímos um detalhe a mais.

A vida é elétrica

A vida funciona com eletricidade. Cada momento de um ser vivo é governado por reações químicas coordenadas, a partir de transferências de cargas elétricas. Se pensarmos um instante que no corpo há milhares e milhares de moléculas que participam deste programa químico coordenado, podemos começar a entender como a vida é complexa. Você pode imaginar o tipo de "software" necessário para controlar esta máquina incrível ? Um programa principal para controlar a máquina da vida precisa ser muito robusto e forte.

No entanto, ao mesmo tempo em que a vida é dirigida por um programa incrivelmente forte, ela também é muito frágil. Com bilhões de reações químicas (elétricas) que ocorrem no corpo em apenas um dia, erros tendem a surgir. É preciso apenas um erro não identificado na construção de uma nova molécula no interior da máquina e o equilíbrio poderia ser quebrado, levando o corpo de um estado saudável à doença. Um bug no software e as consequências podem ser graves para a máquina.

Contudo, a máquina tem o seu próprio software de controle de qualidade que funciona junto com o principal e, por isso, quando as coisas saem errado, o software guardião é ativado e a grande maioria dos erros é corrigida muito rapidamente. Em uma célula, se o software de controle de qualidade detecta um erro e não pode corrigi-lo, outras medidas de controle são iniciadas, e a célula pode determinar sua própria morte ou ir a um estado de paralisia chamado de senescência celular (2,3) (vamos lembrar disso mais tarde).

Proteínas, interruptores elétricos

No corpo, os mestres das reações químicas (elétricas) que conduzem a vida são moléculas que chamamos de proteínas. As proteínas são grandes estruturas feitas de outras menores, conhecidas como aminoácidos. Embora muitos aminoácidos existam na natureza, há um número limitado deles considerados essenciais para a vida. Todas as proteínas presentes no corpo são feitas dos mesmos aminoácidos e são suas combinações específicas, codificadas no DNA, que criarão diferentes proteínas funcionais. Combinações corretas de aminoácidos são fundamentais, pois cada um tem suas próprias propriedades elétricas. Então, você pode perceber aqui que se uma proteína conduz reações elétricas de uma certa maneira devido à sua conformação (posicionamento da cadeia de aminoácidos), então imagine o que pode acontecer quando a conformação está errada. Um aminoácido mal colocado e a proteína pode tornar-se inativa ou ativa demais.

Apesar de serem os mestres da vida, nem todas as proteínas realizam reações químicas e, quando o fazem, são chamadas de enzimas. Podemos pensar em enzimas como interruptores químicos (elétricos) de parede. Suas atividades permitem que o corpo funcione corretamente e reaja muito rápido a estímulos internos e externos.

Figura 1. As proteínas são como interruptores elétricos

Manutenção & Suprimentos

Normalmente, as enzimas não funcionam sozinhas. Pelo contrário, na maioria das vezes elas atuam em conjunto com os outras de uma forma que poderíamos compará-las com os blocos de uma cadeia de dominó, onde o primeiro bloco atinge outro e este atinge um terçeiro, para gerar um efeito no final da linha. No caso das enzimas, a reação química, ou o sinal, irá fazer a célula que o está recebendo se comportar de uma maneira apropriada para responder à causa do sinal.

Figura 2 . Uma cascata de enzimas é como um efeito dominó

Wikimedia commons

Um sinal químico pode começar como uma resposta ao tempo lá fora, em uma estação de esqui ou na praia. Seja o tempo frio ou quente, o corpo irá responder para equilibrar a temperatura interna com a do meio ambiente, através de centenas de reações químicas em muitos tecidos e órgãos. Como mencionado acima, se todos os sinais estão sob controle, o corpo irá responder de forma adequada, de outro modo, haverá problemas à frente.

Entendendo a acondroplasia

Todos esses conceitos são importantes, porque eles podem nos ajudar a entender o que acontece em condições clínicas como a acondroplasia. Na acondroplasia, uma dessas proteínas ativas, o FGFR3 (Figura 3), contém uma modificação na sua estrutura, uma mutação, que faz com que seja mais ativa do que o habitual. Se o erro de construção do FGFR3 acontecesse em um corpo adulto, é provável que o software de controle de qualidade pudesse enxergá-lo e resolvê-lo, caso contrário o erro poderia conduzir ao câncer (veja abaixo).

No entanto, como na acondroplasia o erro é inato (o que é chamado no jargão técnico de uma mutação germinativa), a mutação não seria reconhecida como um erro pelo controle de qualidade pois está no código do DNA desde o princípio. Se um erro está causando muitos problemas desde o início, a nova forma de vida em desenvolvimento (o embrião) não será bem sucedida. Na acondroplasia, o FGFR3 alterado exerce uma influência indevida desde o início, que prejudica o crescimento ósseo já no útero, mas em uma intensidade que usualmente não ameaça a vida. No entanto, com uma enzima receptora workaholic na máquina, o programa de desenvolvimento do novo ser terá dificuldades (ver abaixo).

Figura 3. Um modelo estrutural de FGFR3

LLNL Biosciences

Sinais químicos levam à acondroplasia

Após o nascimento, o FGFR3 é produzido quase que exclusivamente, ou seja, de forma relevante, por células chamadas condrócitos, que vivem dentro de uma região muito especializada nas extremidades dos ossos longos, a placa de crescimento cartilaginosa.

A função normal do FGFR3 é ajudar os condrócitos a controlar sua própria velocidade de proliferação (multiplicação) e maturação. Se o FGFR3 está ausente, os ossos crescem excessivamente e consequências danosas também surgem. (4) Portanto, em condições normais, o FGFR3 é um importante freio para o crescimento natural dos condrócitos. No entanto, uma vez que na acondroplasia o FGFR3 está sinalizando em excesso, o resultado é que os condrócitos simplesmente param de proliferar e amadurecer, o que causa uma parada do crescimento ósseo em geral e às características clínicas dessa condrodisplasia.

Mencionamos que as enzimas não trabalham sozinhas, e o FGFR3 não é uma exceção. Ele está associado a uma série de cascatas de enzimas para exercer suas funções (Figura 4) e nós vamos revisitar uma delas, a da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK), que foi a explorada pelo estudo que veremos no próximo artigo do blog.

A cascata MAPK

Nos últimos anos, um número crescente de evidências tem sido publicado apontando a cascata enzimática MAPK como o provável principal motor da parada do crescimento ósseo visto na acondroplasia. (5)

Figura 4. Cascatas de sinalização do FGFR3



Por exemplo, vários estudos que exploram o peptídeo natriurético tipo C (CNP) contribuíram muito para a compreensão de como a sinalização da MAPK prejudica o crescimento ósseo. (6-9) Isto, por sua vez, resultou no desenvolvimento da primeira terapia farmacológica potencial para a acondroplasia, o análogo do CNP BMN-111 (10), agora prestes a entrar na fase 2 do seu desenvolvimento clínico. Para saber mais sobre o desenvolvimento clínico de um novo medicamento potencial você pode visitar este artigo anterior do blog.

O FGFR3 é uma antena química

A cascata MAPK está representada na figura 4 acima de uma forma muito simplificada. Em resumo, o FGFR3 é chamado de enzima receptora (ou tecnicamente, uma tirosina-quinase receptora) porque ele está situado cruzando a membrana celular (a capa) do condrócito (Figura 3), como uma antena sobre o telhado de um edifício, esperando sinais de TV. O estado natural do FGFR3 é inativo (ou desligado). Já revi este tema em outros artigos deste blog.

Figura 5. FGFR3, uma antena no telhado da célula

Wikimedia commons

O FGFR3, como uma antena de TV pronta para receber apenas ondas de TV, aceitará estímulos específicos apenas de proteínas chamadas FGFs. Quando um FGF se liga ao FGFR3, o receptor torna-se ativo (ou ligado), o que causa uma alteração no corpo do FGFR3, que por sua vez irá gerar uma carga elétrica, o sinal, o qual é produzido pelo deslocamento de alguns íons de fósforo (um fenômeno chamado de fosforilação) na parte do receptor que fica no interior da célula.

Este sinal elétrico/químico vai ser conduzido a outras moléculas vizinhas e, ao viajar de uma para a outra, como na cadeia de dominó, o sinal vai atingir a primeira enzima da cascata da MAPK, que é chamada de Ras. A Ras é ativada e ativará a enzima seguinte na via, chamada Raf, que irá então ativar a MEK, que por sua vez transfere o sinal para uma outra enzima chamada ERK. A ERK é o mensageiro que levará o sinal trazido pelo FGF lá de fora para o núcleo da célula, onde o programa celular vai reagir de acordo com o sinal recebido (Figura 3). 

Sugiro que você assista ao seguinte vídeo (14 min), que mostra uma animação rica e detalhada de uma cascata de sinalização em ação, com a correspondente resposta da célula. As células podem responder a sinais externos produzindo novas proteínas e a animação mostra este processo.


Animação. Cascata de sinalização enzimática e o processo de transcrição do DNA.

DNA Learning Center by Cold Spring Harbor Laboratory

A cascata de sinalização MAPK em condrócitos

A MAPK é um fator-chave de funções celulares importantes em todos os tecidos do corpo. Isto implica que a MAPK responde a um número grande de antenas celulares, não só ao FGFR3 (visite este artigo em inglês na Wikipedia para ver a figura que mostra as interações conhecidas da MAPK).

Normalmente, a MAPK funciona como um gatilho de crescimento: as células estimuladas via MAPK começam a se multiplicar e sobrevivem por mais tempo. Esta propriedade é facilmente reconhecida por células cancerosas, que frequentemente usam a MAPK para se multiplicar mais rápido. Não é de estranhar que, ultimamente, temos assistido o desenvolvimento de vários novos compostos visando enzimas da cascata MAPK para tratar vários tipos de câncer (revisto aqui).

No entanto, como acabamos de mencionar acima, condrócitos reagem à MAPK exatamente no sentido oposto, e reduzem o seu ritmo de crescimento quando sob influência da sinalização da MAPK. (11) Como isso ocorre? A hipótese do Dr. Pavel Krejci pode responder esta pergunta. (1)

Em sua análise, ele postula que este comportamento dos condrócitos seria uma reação natural ao que eles reconhecem como um sinal errado que vem do FGFR3 mutante. Em outras palavras, devido à superatividade do FGFR3 produzir um excesso de estimulação no crescimento de condrócitos da placa de crescimento, estas células se defendem entrando em um modo de pausa, a senescência celular citada acima. Elas desligam a eletricidade.

Você lembra o que mencionamos no início deste artigo, que há um programa de controle de qualidade que funciona junto com o programa principal, executado na máquina (no corpo), para garantir que as reações químicas estão indo no caminho certo? Assim, a hipótese do Dr. Krejci pode ser uma boa explicação para o comportamento excepcional de condrócitos que enfrentam um excesso de atividade do FGFR3. A célula pode não ver o FGFR3 mutante como uma questão, mas consegue perceber que algo está errado com a excessiva sinalização da MAPK.

Portanto, a acondroplasia seria a consequência final dos condrócitos "diagnosticarem" a sinalização excessiva da MAPK como um problema, ativando assim o software de controle de qualidade para entrar em uma espécie de modo de pausa, a fim de proteger-se do dano potencial que pode ocorrer com o excessivo estímulo ao crescimento, que sabemos ser comum no câncer. Eles se mantêm com as funções celulares básicas, mas param o essencial programa de proliferação para o crescimento ósseo. O resultado são ossos longos curtos, um estreito canal na coluna vertebral e as consequências clínicas da acondroplasia.

FGFR3 e MAPK em células ósseas

Uma vez que há evidências de que o FGFR3 hiperativo também provoca alterações em células do osso (osteoblastos), também é útil ver o que acontece com essas células sob a influência da via FGFR-MAPK. Temos informações sobre isso, por exemplo, que vem de um estudo realizado pelo grupo do Dr. Sunichi Murakami. Em um de seus recentes trabalhos, exploraram a inibição do FGFR3 e da MEK em osteoblastos in vitro e in vivo, e concluiram que a via da MAPK é também muito importante para a saúde dos ossos. (12) 

Conclusão

Uma pergunta que podemos fazer sobre a hipótese do Dr Krejci é relacionada ao próprio mecanismo de ação do FGFR3. Se o FGFR3 é um freio natural para o crescimento ósseo, e age naturalmente através da cascata MAPK, por que condrócitos lançariam mão do processo de senescência, já que o sinal essencial ("pare de crescer") não mudou? Pode ser que o que ativa o processo de senescência seja um "nível" interno de atividade da via MAPK, que quando cruzado, ativa o processo de parada, mas o mecanismo pelo qual isto aconteceria não está claro.

Aproveitando a discussão sobre a ação da MAPK, no próximo artigo vamos analisar outro estudo, onde pesquisadores testaram um par de compostos criados para inibir a MAPK no câncer. O que é relevante em seu trabalho é que eles exploraram esses compostos no osso e na placa de crescimento, com consequentes implicações para várias estratégias de desenvolvimento para o tratamento de acondroplasia.

Referências

1. Krejci P. The paradox of FGFR3 signaling in skeletal dysplasia: why chondrocytes growth arrest while other cells over proliferate. Mut Res 2013; http://dx.doi.org/10.1016/j.mrrev.2013.11.001. 

2. Campisi J & Fagagna FA. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Rev Mol Cell Biol 2007;8:729-40.

3. Campisi J. Cell biology: the beginning of the end. Nature 2013; doi:10.1038/nature12844. Published online 18 December 2013.

4. Toydemir RM et al. Novel mutation in FGFR3 causes camptodactyly, tall stature, and hearing loss (CATSHL) Syndrome. Am J Hum Genet 2006;79(5):935-41. Acesso livre

5. Foldynova-Trantirkova S et al. Sixteen years and counting: the current understanding of 
fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) signaling in skeletal dysplasias. Hum Mutat 2012; 33:29–41. Acesso livre

6. Krejci P et al. Interaction of fibroblast growth factor and C-natriuretic peptide signaling in regulation of chondrocyte proliferation and extracellular matrix homeostasis. J Cell Sci 2006; 118: 5089-00. Acesso livre

7. Nakao K et al. Impact of local CNP/GC-B system in growth plates on endochondral bone growth. Pharmacol Toxicol 2013; 14 (Suppl 1):48. Acesso livre
 
8. Yasoda A et al. Systemic Administration of C-Type Natriuretic Peptide as a Novel Therapeutic Strategy for Skeletal Dysplasias. Endocrinology 2009;150: 3138–44.

9. Yasoda A and Nakao K. Translational research of C-type natriuretic peptide (CNP) into skeletal dysplasias. Endocrine J 2010; 57 (8): 659-66. Acesso livre
 
10. Lorget F et al. Evaluation of the therapeutic potential of a CNP analog in a Fgfr3 mouse model recapitulating achondroplasia. Am J Hum Genet 2012;91(6):1108-14. Acesso livre

11. Murakami S et al. Constitutive activation of MEK1 in chondrocytes causes Stat1-independent achondroplasia-like dwarfism and rescues the Fgfr3-deficient mouse phenotype. Genes Dev 2004;18(3):290-305. Acesso livre

12. Kyono A et al. FGF and ERK signaling coordinately regulate mineralization-related genes and play essential roles in osteocyte differentiation. J Bone Miner Metab 2012;30(1):19-30. Acesso livre

Why do chondrocytes stop in achondroplasia?

Introduction

The purpose of this article is to revisit the origin of achondroplasia from a new perspective, inspired by a very interesting article from Dr. Pavel Krejci, an enthusiastic researcher of fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) biology and a strong contributor for the research in achondroplasia, published just few weeks ago.(1) The text here tries to explain the hypothesis brought by Dr Krejci.

This short review will also helps us to get into the next article planned for the blog, which is about blocking the enzymatic cascade discussed here. I know that the 17 original blog readers may find this text a bit repetitive but, while we gain more insight about achondroplasia, there is always a piece more of detail included. 

Life is electric 

Life runs on electricity. Every single moment of a living being is ruled by coordinated chemical reactions conducting electric charge transfers. If we take an instant to remember that in the body there are thousands and thousands molecules participating in this coordinated chemical program, we can start to see how life is complex. Can you imagine the kind of "software" needed to control this amazing machine? A chief program to run the life machinery does need to be very robust and strong. 

However, at the same time life is run by an incredibly strong program, it is also very fragile. With billions of chemical (electric) reactions occurring in the body in just one day, errors are prone to arise. It needs just one uncharted mistake in building a new molecule inside the machine and the balance could be broken, leading the body from a healthy state to disease. A bug in the software and consequences could be severe to the machine. 

Notwithstanding, the machine has its own quality control software running together with the chief one, so when things go wrong, the guardian software is activated and most errors are corrected very fast. In a cell, if the quality control software detects an error and can't correct it, other control measures start, and the cell can drive itself to death or to a paralyzed state called cell senescence (2,3) (save this for later).

Proteins, electric switches

In the body, the masters of those chemical (electric) reactions driving life are molecules we call proteins. Proteins are large structures made of smaller ones, called amino acids. Although many amino acids exist in nature, there is a limited number of them considered essential for life. All proteins in the body are made of the same amino acids and it is their specific combinations, written in the DNA code, that will make different functional proteins. Amino acid combinations are key because each one has its own electric properties. So, you see here, if a protein conduct electric reactions in a certain way due to its conformation, then imagine what can happen when its conformation is wrong. An amin acid in the wrong position and the protein may become inactive or too active.

Although being key rulers of life, not all proteins conduct chemical reactions and when they do so, they are called enzymes. We can think in enzymes like chemical (electric) wall switches. Their functions allow the body to work correctly and to react very fast to internal and external stimuli.

Figure 1. Proteins are like electric switches

Manutenção & Suprimentos 

Usually, enzymes don’t work alone. On the contrary, most of the time they act in concert with others in a way that we could compare them with blocks of a domino cascade, where the first block hits another and this one hits a third, to generate an effect in the end of the row. In the case of enzymes, the chemical reaction, or signal, will make the cell which is receiving it to behave in an appropriate way to respond to the cause of the signal.

Figure 2. An enzyme cascade is like a domino chain 

commons.wikimedia.org

A chemical signal may start as a response to the weather outside, at a ski resort or at the beach. Either way, cold or hot weather, the body will respond to balance the internal temperature with that of the environment, through hundreds of chemical reactions across the tissues and organs. As mentioned above, if all signals are under control, the body will respond in a proper way, otherwise, there will be problem ahead.

Understanding achondroplasia

All of these concepts are important to review because they can help us to learn what happens in clinical conditions such as achondroplasia. In achondroplasia, one of those active proteins, FGFR3 (Figure 3), contains a modification in its structure, a mutation, that makes it more active than usual. If the building mistake happened in an adult body, it is likely that the quality control software would pick it and solve it, otherwise the error could drive to cancer (see below). 

However, as in achondroplasia the mistake is built in (what is called in technical jargon a germline mutation), the mutation is not recognized as a mistake (it is inside the DNA code from the beginning) and the quality control will not recognize it as an error. If an error is causing so much trouble from the beginning, the new form of life in development (the embryo) would not be successful. In achondroplasia, the mistaken FGFR3 exerts an undue influence from the beginning (it impairs bone growth already in utero), but keeps being compatible with life. Nevertheless, with a workaholic receptor enzyme in the machine, the development program will have trouble (see below).

Figure 3. A structural model of FGFR3

 

LLNL Biosciences

Chemical signals driving achondroplasia 

After birth, FGFR3 is almost exclusively produced, that is, in a relevant way, by cells called chondrocytes, living within a very specialized region in the extremities of the long bones, the cartilage growth plate. The normal function of FGFR3 is to help chondrocytes to control their own proliferation (multiplication) and maturation speed. If FGFR3 is absent, bones grow excessively and ill consequences also arise. (4) Therefore, in normal conditions, FGFR3 is an important natural growth brake for chondrocytes. However, since in achondroplasia FGFR3 is signaling in excess, the result is that chondrocytes simply stop to proliferate and mature, leading to a general bone growth arrest and to the clinical features of this chondrodysplasia.

We mentioned that enzymes do not work alone, and FGFR3 is not an exception. It relies on a number of enzyme cascades to exert its functions (Figure 4) and we are going to revisit one of them, the mitogen-activated protein kinase (MAPK), which was the one explored by the study we will see in the next article.

The MAPK pathway

Over the last years, an increasing amount of evidence has been published pointing the MAPK enzymatic cascade as the likely key driver of the bone growth arrest seen in achondroplasia. (5)

Figure 4. FGFR3 signaling cascades

For instance, several studies exploring the use of c-type natriuretic peptide (CNP) have contributed much for the understanding of how MAPK signaling impairs bone growth. (6-9) This in turn resulted in the development of the first potential pharmacological therapy for achondroplasia, the CNP analogue BMN-111 (10), now about to enter phase 2 of its clinical development. To learn more about the clinical development of a new potential drug you could visit this previous article of the blog.

FGFR3 is a chemical antenna
  
The MAPK cascade is represented in the above figure 4 in a very simplified way. In short, FGFR3 is called a receptor enzyme (or technically, a receptor tyrosine kinase) because it is placed across the cell membrane (the cover) of the chondrocyte (Figure 3), like an antenna on the roof of a building, waiting for TV signals coming from outside. The natural state of FGFR3 is inactive (or power off). We have already reviewed this topic in other articles of this blog. 

Figure 5. FGFR3, a cell roof antenna

Wikimedia commons

FGFR3, like a TV antenna ready to receive only TV waves, will receive signals only from some specific proteins called FGFs. When a FGF binds FGFR3, it turns the receptor active (or power on), causing a change in the body of FGFR3 that will generate an electric charge, the signal, which is produced by the dislocation of some phosphorus ions (a phenomenon called phosphorylation) in the part of the receptor placed inside the cell. 

This electric / chemical signal will be driven to other molecules nearby and, by travelling from one to the next, like in the domino chain, the signal will reach the first enzyme of the MAPK cascade, which is called Ras. Ras is turned on and will activate the next enzyme in the pathway, called Raf, which will then activate MEK, which in turn will transfer the signal to another enzyme called ERK. ERK is the messenger that will take the signal brougth by the FGF upstairs to the cell nucleus, where the cell program will react accordingly (Figure 3). I suggest you to watch the following 14 min video, showing a rich and detailed animation of a signaling cascade in action, with the corresponding cell response. Cells can respond to external signals by producing new proteins and the animation shows this process. 

DNA Learning Center by Cold Spring Harbor Laboratory

The MAPK cascade signaling in chondrocytes

The MAPK pathway is a key driver of important cell functions in all tissues of the body. This implies that MAPK responds to a large number of cell antennas, not only FGFR3 (visit this article in Wikipedia to see the figure showing known MAPK interactions). 

Normally, MAPK works as a growth trigger: cells estimulated via MAPK start to multiply and survive longer. This property is readily recognized by cancer cells, which frequently use MAPK to grow more and fast. It is not surprising that lately, we have been witnessing the development of several new compounds targeting enzymes of the MAPK cascade to treat several kinds of cancer (reviewed here).

However, as we have just mentioned above, chondrocytes react to MAPK exactly in the opposite way, and reduce their growth pace under the influence of MAPK signaling. (11) How can this happen? Dr. Pavel Krejci's hypothesis might have answered this question. (1)

In his review, he postulates that this chondrocyte behavior would be a natural reaction to what they recognize as a wrong signal coming from the mutated FGFR3. In other words, due to the over active FGFR3 producing an excess of growth stimulation in chondrocytes of the growth plate, these cells defend themselves by entering in a kind of stop mode, the above mentioned cell senescence. They switch off the electricity.

Do you remember what we mentioned in the beginning of this article, that there is a quality control program running together with the master program which runs the body machine, to ensure that the chemical reactions are going in the right way? So, the hypothesis by Dr Krejci may be a good explanation for the exceptional behavior of chondrocytes facing an over active FGFR3. The cell might not see the mutated FGFR3 as an issue, but can perceive something is going wrong with the excessive MAPK signaling. 

Therefore, achondroplasia would be the final consequence of chondrocytes "diagnosing" the excessive signaling of MAPK as a problem, thus activating the quality control software to enter in a kind of stop mode, to protect themselves from the potential harm of excessive growth stimulation which we know is common in cancer. They keep with basic cell functions, but stop the proliferation program essential for bone growth. The result is shorter long bones, narrow spine canal and the clinical consequences seen in achondroplasia.

FGFR3 and MAPK in bone cells

Since there is evidence that the overactive FGFR3 also causes change in bone cells (osteoblasts), it is also useful to see what happens with those cells under influence of the FGFR-MAPK pathway. We do have information about this, for instance coming from a study by the Dr Sunichi Murakami's group. In one of their recent works, they explored the inhibition of FGFR3 and MEK in osteoblasts in vitro and in vivo, and concluded that the MAPK pathway is also very important for bone health. (12)

Conclusion

One question we can ask about the hypothesis by Dr. Krejci is related to the actual mechanism of action of FGFR3. If FGFR3 is a natural brake for bone growth, and acts naturally through the MAPK cascade, why would chondrocytes launch the senescence process, since the essential signal ("stop growing") has not changed? Perhaps what activates the senescence process is an internal "cut-off" of the MAPK pathway activity, which when crossed, triggers the process of growth pause, but the mechanism by which this would be happening is unclear.

Taking advantage of the discussion on the MAPK cascade actions, in the next article we will review another study, where researchers tested a couple of small molecules created to target the MAPK pathway in cancer. What is relevant in their work is that they explored those compounds in bone and in the growth plate, with consequent implications for several strategies in development to treat achondroplasia.

References

1. Krejci P. The paradox of FGFR3 signaling in skeletal dysplasia: why chondrocytes growth arrest while other cells over proliferate. Mutat Res Rev Mutat Res. 2014;759:40-8.

2. Campisi J & Fagagna FA. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Rev Mol Cell Biol 2007;8:729-40.

3. Campisi J. Cell biology: the beginning of the end. Nature 2013; doi:10.1038/nature12844. Published online 18 December 2013.

4. Toydemir RM et al. Novel mutation in FGFR3 causes camptodactyly, tall stature, and hearing loss (CATSHL) Syndrome. Am J Hum Genet 2006;79(5):935-41. Free access

5. Foldynova-Trantirkova S et al. Sixteen years and counting: the current understanding of 
fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) signaling in skeletal dysplasias. Hum Mutat 2012; 33:29–41. Free access

6. Krejci P et al. Interaction of fibroblast growth factor and C-natriuretic peptide signaling in regulation of chondrocyte proliferation and extracellular matrix homeostasis. J Cell Sci 2006; 118: 5089-00.

7. Nakao K et al. Impact of local CNP/GC-B system in growth plates on endochondral bone growth. Pharmacol Toxicol 2013; 14 (Suppl 1):48.

8. Yasoda A et al. Systemic Administration of C-Type Natriuretic Peptide as a Novel Therapeutic Strategy for Skeletal Dysplasias. Endocrinology 2009;150: 3138–44.

9. Yasoda A and Nakao K. Translational research of C-type natriuretic peptide (CNP) into skeletal dysplasias. Endocrine J 2010; 57 (8): 659- 66.

10. Lorget F et al. Evaluation of the therapeutic potential of a CNP analog in a Fgfr3 mouse model recapitulating achondroplasia. Am J Hum Genet 2012;91(6):1108-14. Free access

11. Murakami S et al. Constitutive activation of MEK1 in chondrocytes causes Stat1-independent achondroplasia-like dwarfism and rescues the Fgfr3-deficient mouse phenotype. Genes Dev 2004;18(3):290-305. Free access

12. Kyono A et al. FGF and ERK signaling coordinately regulate mineralization-related genes and play essential roles in osteocyte differentiation. J Bone Miner Metab 2012;30(1):19-30. Free access