Tratando la acondroplasia: el papel de los inhibidores de la tirosina-quinasa

Traducción: Maria Cristina Terceros

Introducción

La acondroplasia es causada por una mutación en el gen que codifica (contiene la información química para crear) la proteína llamada receptor del factor de crecimiento de fibroblastos tipo 3 (FGFR3). El FGFR3 es una proteína que se encuentra anclada a través de la membrana celular de los condrocitos (Figura 1). Posee tres partes o dominios: la parte que se encuentra fuera de la célula y que funciona como una antena, recibiendo señales de los FGFs; el dominio transmembrana, que es "anclado" en la proteína a través de la pared celular; y el dominio intracelular, el cual es el responsable por la propagación de la señal recibida fuera de la célula para otras proteínas dentro de la célula.

Figura 1. Estructura del FGFR3.

 
Las proteínas son moléculas grandes y complejas constituidas por partes más pequeñas que tienen el nombre de aminoácidos. Estos aminoácidos son como piezas de un modelo de Lego: cada uno tiene características diferentes que, combinado con otros, confieren formas y propiedades especiales a la proteína (Figura 2). Por lo tanto, la combinación correcta de aminoácidos es esencial para la función normal de la proteína. (Si usted está curioso y quiere saber más sobre aminoácidos, puede visitar la página Glosario del blog para recabar algunas informaciones o también ir a la Wikipedia)

Figura 2. Combinando piezas de Lego.

La combinación adecuada de aminoácidos en una proteína es crucial para su correcto funcionamiento. En la acondroplasia, una substitución única (la mutación) de uno de estos aminoácidos, deja al FGFR3 más activo de lo que debería. La función normal del FGFR3 es reducir la velocidad de crecimiento del hueso a partir de algunas estructuras estrechas que se localizan en las extremidades de los huesos largos llamadas placas de crecimiento. Debido a la mutación, el FRFR3 trabaja exageradamente y reduce significativamente la capacidad de multiplicación y división de los condrocitos que viven en las placas de crecimiento, lo que lleva a las características clínicas de la acondroplasia.

¿Por qué sucede esto?

Las proteínas que participan en las reacciones químicas en el cuerpo tienen el nombre de enzimas. Las enzimas son bastante activas y el FGFR3 no es diferente. Para controlar las actividades de las enzimas, las células poseen sistemas de “limpieza” que permiten que esas enzimas, cuando están encendidas (o activadas), trabajen solamente por un periodo limitado de tiempo. En la acondroplasia, la mutación hace con que el FGFR3 sea más estable y “resistente” a esos limpiadores, y por eso consigue mantenerse activo por más tiempo.

Bueno, pero eso, ¿qué tiene que ver con el título de este artículo?

Esperemos un poco más. Ya estamos llegando.

Una enzima funciona a través de la transferencia de cargas eléctricas hacia otra proteína (un cliente, que puede ser otra enzima), provocando alteraciones en el cliente. El cliente llevará la carga eléctrica para otro destino, por ejemplo, hacia otra proteína, hacia un determinado lugar en el interior del núcleo de la célula, etc. Va a depender de su(s) función(es). Imaginemos una hilera de dominó, una pieza empujando a la siguiente, etc. Es de esta manera que funcionan las células. Para ayudarle a comprender las reacciones químicas enzimáticas de señalización en cadena o en cascadas, le invito a que vea la película animada que viene a continuación, provista por el Laboratorio Cold Spring Harbor, que publiqué en un artículo anterior del blog (Animación 1).

Animación 1. Esta película animada muestra como el cuerpo va iniciando el proceso de cicatrización después de una contusión en la piel. La parte relevante comienza a los 2:50 minutos, donde se muestra como un ligante (imaginemos un FGF) se une a una enzima receptora en la superficie de una célula (imaginemos el FGFR3) y comienza la cascada de señalización o cascada química. 

DNA Learning Center. Cold Spring Harbor Laboratory

Las enzimas son capaces de transferir esas cargas eléctricas debido a que algunos de los aminoácidos en sus estructuras tienen las propiedades químicas adecuadas para hacerlo. En el caso del FGFR3, existen algunos puntos en la parte que está localizada dentro de la célula ocupada por el aminoácido tirosina (Ver Figura 1). La tirosina se puede unir con algunos cargadores (transportadores) de fósforo reactivo (ATP) que fluctúan en las cercanías dentro de la célula, pero sólo lo hará si es que el FGFR3 es activado (encendido) fuera de la célula. Cuando el FGFR3 es activado (¿vio usted la animación?), a través de variadas y complejas alteraciones en su formato, él expone las tirosinas en su parte intracelular, las cuales a su vez atraen al fósforo en las cercanías, iniciando una serie de reacciones químicas. Usted debería tener en cuenta que aquí estoy simplificando bastante el fenómeno de la “activación”.

 Las regiones donde están localizadas las tirosinas dentro del FGFR3 tienen el nombre de “bolsas” de ATP. Estas bolsas están presentes en otras muchas enzimas con muchas y diferentes funciones en las células, de modo que esas estructuras no son exclusivas del FGFR3. Nosotros también llamamos dominios de tirosina-quinasa (TKD) a esas regiones (Figura 1).

¡Bien, finalmente vemos una conexión con el título!

Desde hace décadas, los científicos conocen estas bolsas de ATP. Ellos descubrieron que, en el cáncer, muchas de las enzimas como el FGFR3 son utilizadas por las células malignas para hacerlas crecer más y más rápidamente. Fue entonces que ellos comenzaron a buscar abordajes que fuesen capaces de bloquear esas bolsas. En teoría, sin las reacciones químicas proporcionadas por enzimas como el FGFR3, muchas células cancerígenas morirían y la enfermedad sería potencialmente controlada.

En realidad, los científicos ya desarrollaron una serie de estrategias para alcanzar ese objetivo. Una de esas estrategias se da exactamente por medio de la creación de moléculas que pueden unirse a los TKD, impidiendo que la enzima inicie las reacciones químicas. Esas moléculas tienen el nombre de inhibidores de tirosina-quinasa (TKI). Ya revisé muchas de ellas con actividad contra el FGFR3 aquí en este blog, pero en la Tabla 1, usted podrá ver una lista más reciente de ellas.

Tabla 1. Algunas nuevas TKIs activas contra los FGFRs. 

Para comprender mejor como es que funcionan esas pequeñas moléculas, le invito a ver esta rica animación que muestra el mecanismo de acción del lapatinib (Animación 2), un TKI desarrollado para bloquear EGFRs, otro tipo de enzimas que trabaja de manera semejante a los FGFRs. Verá que el lapatinib tiene como objetivo las bolsas de ATP en la parte intracelular del EGFR.

Animación 2. Mecanismo de acción del lapatinib (audio en italiano). 

¿Utilizar TKIs en la acondroplasia?

Ya que existen tantas moléculas capaces de bloquear la actividad del FGFR3, ¿por qué no vemos más investigaciones abordando su uso dentro de la acondroplasia? Esos medicamentos podrían ser tomados como comprimidos, una vez al día. ¿No sería perfecto? El problema está, como mencionamos anteriormente, en que las bolsas de ATP (los dominios de la tirosina-quinasa) son bastante parecidas en un gran número de familias de enzimas que trabajan como los FGFRs. ¿Usted se dio cuenta de que no escribí FGFR3 en el título de la Tabla 1? Esto se debe a que ninguno de los compuestos mencionados allí es específico para el FGFR3. Ellos también pueden bloquear la actividad de otros FGFRs y de otras enzimas celulares. Para ilustrar ese recurso del TKIs, puede darle un vistazo al mapa de las familias de enzimas que presentamos a continuación (Figura 3), el cual muestra los grupos de enzimas que algunos TKIs son capaces de bloquear.

Figura 3. Mapa de las enzimas mostrando aquéllas que están afectadas por algunos de los TKIs más viejos. Cada punto de color significa que el TKI tendrá alguna acción sobre aquella enzima. Véase la forma como ha sido dibujado el mapa, como un árbol visto desde arriba.

Ver el gran número de enzimas afectadas por esos TKIs. Imagen de:Stjepanovic N & Capdevila J. Biologics: Targets and Therapy 2014. Aceso libre. Reproducido aquí solamente para fines educativos.

Afectar al mismo tiempo diversas enzimas y sus diferentes funciones, puede representar un problema enorme. Varios efectos indeseados pueden surgir cuando esas drogas son utilizadas para tratamientos contra el cáncer. Sin embargo, algunos de los efectos adversos son tolerables o aceptables debido a la naturaleza de la enfermedad, y también porque, a pesar de afectar varias enzimas al mismo tiempo, los inhibidores de la tirosina-quinasa tienden a ser menos tóxicos que el arsenal de quimioterapia más antiguo, que continúa siendo usado en la actualidad para la lucha contra el cáncer.

De hecho, muchos TKIs, como los anteriormente mencionados, ya están siendo utilizados en la práctica clínica para el tratamiento de varias formas de cáncer, pero solo en adultos. Como su actividad es promiscua podemos prever que los TKI podrían ser peligrosos para el uso en niños, cuyos cuerpos todavía se encuentran en crecimiento. Esas enzimas participan de procesos fundamentales en el desarrollo y bloquearlas en un niño podría causar muchas y malas consecuencias.

Investigadores como el Dr. Moosa Mohammadi, de la New York University, y la Dra Kalina Hristova, de la Johns Hopkins University, han trabajado duro para comprender mejor el grupo de enzimas FGFRs y/o las bolsas de ATP. Ellos crean modelos de las enzimas, computarizados en 3D, e intentan mapear dónde es que se localizan los aminoácidos, para poder prever cómo es que trabajan estas enzimas y así poder ayudar a desarrollar nuevas moléculas para caber en los lugares correctos, aunque esto no sea fácil de hacer. Se puede ver el trabajo del Dr. Mohammadi realizando una sencilla investigación dentro del Pubmed.

Los actuales anti-FGFR no pueden ser utilizados en el tratamiento para la acondroplasia

Tal vez debido a los riesgos previsibles, es improbable que los actuales inhibidores de la tirosina-quinasa puedan ser utilizados en la acondroplasia. Existen evidencias en tests de laboratorio de que ellos funcionan (1), pero, debido a su falta de especificidad, estos TKIs no son candidatos que puedan ser utilizados clínicamente para tratar la acondroplasia.

Para traer más datos sobre el uso de TKIs en la acondroplasia, el grupo liderado por el Dr. Pavel Krejci, un entusiasta investigador en el área del FGFR3, acaba de publicar un convincente estudio en el cual se explora exactamente el uso de algunos de esos TKIs, conocidos por ser más específicos para las enzimas de la familia FGFR en condrocitos y en cultivos de hueso (2). Algunos de los inhibidores de las tirosina-quinasa testeados en su trabajo se encuentran en la lista en la Tabla 1 anteriormente presentada. Después de realizada una serie de tests, tanto en cultivo de células, cultivo de huesos y en modelos animales, el grupo concluyó que sería arriesgado usar para tratamientos de la acondroplasia los TKIs actualmente en desarrollo, precisamente porque ellos bloquean otras enzimas importantes para el desarrollo del organismo en crecimiento.

La exclusividad es difícil de ser alcanzada

Para entender por qué esas moléculas creadas para bloquear las bolsas de ATP afectan varias enzimas, vamos a volver al mapa de las enzimas anteriormente mostrado y conferir su distribución. Usted podrá ver que los manojos (o haces) de las familias de esas enzimas surgen de un tronco principal, como si se tratase de un árbol. Esto significa que aunque existan centenares de enzimas diferentes en la actualidad, todas provienen de pocos antepasados, y por eso mantienen una gran semejanza entre ellas, a lo que los científicos dan el nombre de homología. Los cuatro FGFRs son bastante parecidos, compartiendo más del 50% de su estructura entre los cuatro miembros (3).

Tal y como fue señalado por diferentes investigadores, incluyendo al Dr. Krejci, una molécula exitosa del grupo TKI en el tratamiento de la acondroplasia, tendrá que ser bastante selectiva con el FGFR3, sin ningún efecto en las proteínas hermanas o en las enzimas de otros grupos. Esto aún tomará un buen tiempo para conseguirse, y el éxito se basará, por lo menos en parte, en perfeccionar la capacidad de proyectar modelos de enzimas que sean capaces de disimular su estado natural y su dinámica en la célula viva en la computadora (ordenador).

Esto solamente significa que necesitamos estar abiertos ante las diferentes opciones disponibles para enfrentar enzimas hiperactivas, como el FGFR3 en la acondroplasia. Las bolsas de ATP han sido los objetivos más estudiados debido a que ellas son fáciles de ser alcanzadas. Sin embargo, existen otros lugares en la estructura de la proteína que pueden ser abordados. Le invito a que pueda leer nuevamente los artículos anteriormente publicados en el blog. Descubrirá que hay muchas ideas por ahí, esperando algún científico que las pueda desarrollar, que no esté pensando solamente en los objetivos más fáciles de ser alcanzados.

Referencias


1. Jonquoy A et al. A novel tyrosine kinase inhibitor restores chondrocyte differentiation and promotes bone growth in a gain-of-function Fgfr3 mouse model. Hum Mol Genet 2012;21(4):841-51. Free access.

2. Gudernova I et al. Multikinase activity of fibroblast growth factor receptor (FGFR) inhibitors SU5402, PD173074, AZD1480, AZD4547 and BGJ398 compromises the use of small chemicals targeting FGFR catalytic activity for therapy of short stature syndromes. Hum Mol Genet 2015 Oct 22. pii: ddv441. [Epub ahead of print].

3. Ho HK et al. Current strategies for inhibiting FGFR activities in clinical applications: opportunities, challenges and toxicological considerations. Drug Discov Today 2014 Jan;19(1):51-62.

Tratando a acondroplasia: o papel dos inibidores de tirosina-quinase

Introdução

A acondroplasia é causada por uma mutação no gene que codifica a (contém a informação química para criar) a proteína chamada receptor de fator de crescimento de fibroblastos 3  (FGFR3). O FGFR3 é uma proteína que está ancorada através da membrana celular dos condrócitos (Figura 1). Ele tem três partes ou domínios: a parte fora da célula que funciona como uma antena, recebendo sinais dos FGFs; o domínio transmembrana, que "ancora" a proteína através da parede da célula; e o domínio intracelular, que é responsável pela propagação do sinal recebido fora da célula para outras proteínas dentro da célula.

Figura 1. Estrutura do FGFR3.

Proteínas são moléculas grandes e complexas constituídas por partes menores chamadas de aminoácidos. Estes aminoácidos são como peças de um modelo de Lego: cada um tem características distintas que, combinado com outros, conferem formas e propriedades especiais à proteína (Figura 2). A combinação certa de aminoácidos é, portanto, essencial para a função normal da proteína. Se você está curioso sobre aminoácidos, basta visitar a página Glossário do blog para algumas informações básicas ou ir a Wikipedia)

Figura 2. Combinando peças de Lego.
 

A combinação certa de aminoácidos em uma proteína é crucial para o seu funcionamento correto. Na acondroplasia uma única substituição (a mutação) de um destes aminoácidos deixa o FGFR3 mais ativo do que deveria. A função normal do FGFR3 é de reduzir a velocidade de crescimento do osso a partir de algumas estreitas estruturas localizadas nas extremidades dos ossos longos chamadas de placas de crescimento. Devido à mutação, o FGFR3 trabalha exageradamente e reduz significativamente a capacidade dos condrócitos que vivem nas placas de crescimento de multiplicar e amadurecer, o que conduz às características clínicas da acondroplasia.

Por que isto acontece?
 
Chamamos as proteínas que participam de reações químicas no corpo de enzimas. As enzimas são muito ativas e o FGFR3 não é diferente. Para controlar as atividades das enzimas, as células têm sistemas de "faxina" que permitem que essas enzimas, quando estão ligadas (ou ativadas), trabalhem somente por um período limitado de tempo. Na acondroplasia, a mutação faz o FGFR3 ficar mais estável e "resistente" a esses faxineiros, e por isso consegue se manter ativo por mais tempo.

Bem, o que isso tem a ver com o título deste artigo?

Espere mais um pouco, estamos chegando lá.

Uma enzima funciona através da transferência de cargas elétricas para outra proteína (um cliente, que pode ser outra enzima), provocando alterações no cliente. O cliente levará a carga elétrica para outro destino, por exemplo, uma outra proteína, um determinado local no interior do núcleo da célula, etc. Vai depender de sua(s) função(ões). Pense em uma cadeia de dominó, uma peça empurrando a próxima, etc. Esta é a forma como as células funcionam. Para ajudar você a entender reações químicas enzimáticas em cadeia  ou cascatas de sinalização, convido você a assistir a animação logo abaixo, fornecida pelo Laboratório Cold Spring Harbor, que publiquei em um artigo anterior do blog (Animação 1).

Animação 1. Esta animação mostra como o corpo começa o processo de cicatrização após uma contusão na pele. A parte relevante começa aos 2:50 min, e mostra como um ligante (pense em um FGF) se junta a uma enzima receptora na superfície de uma célula (pense no FGFR3) e inicia a cascata de sinalização ou química.

DNA Learning Center. Cold Spring Harbor Laboratory

As enzimas são capazes de transferir essas cargas elétricas porque alguns dos aminoácidos nas suas estruturas têm as propriedades químicas adequadas para fazê-lo. No caso do FGFR3, existem alguns pontos na sua parte que está localizada dentro da célula ocupada pelo aminoácido tirosina (ver Figura 1). A tirosina pode se ligar a alguns carreadores (transportadores) de fósforo reativo (ATP) flutuantes nas proximidades dentro da célula, mas só irá fazê-lo se o FGFR3 for ativado (ligado) fora da célula. Quando o FGFR3 é ativado (você viu a animação 1?), através de várias complexas alterações em sua forma, ele expõe as tirosinas na sua parte intracelular, que por sua vez atraem o fósforo nas proximidades, iniciando uma série de reações químicas. Você deve levar em conta que estou simplificando muito o fenômeno de "ativação" aqui.

As regiões onde as tirosinas estão localizadas em FGFR3 são chamados "bolsos" de ATP. Estas bolsos estão presentes em muitas outras enzimas com muitas funções diferentes nas células, de modo que essas estruturas não são exclusivas do FGFR3. Nós também chamamos essas regiões de domínios de tirosina-quinase (TKD) (Figura 1).

Ok, finalmente, vemos uma conexão com o título!

Há décadas, os cientistas sabem sobre estes bolsos de ATP. Eles descobriram que no câncer muitas das enzimas como o FGFR3 são utilizadas pelas células malignas para fazê-las crescer mais e mais rápido, então eles começaram a procurar abordagens que seriam capazes de bloquer esses bolsos. Em teoria, sem as reações químicas fornecidas por enzimas como o FGFR3, muitas células cancerosas morreriam e a doença seria potencialmente controlada.

Na verdade, os cientistas já desenvolveram uma série de estratégias para atingir esse objetivo. Uma delas é exatamente através da criação de moléculas que podem se ligar aos TKD, impedindo a enzima de iniciar reações químicas. Estas moléculas são chamadas inibidores de tirosina-quinase (TKI). Já revi muitas delas com atividade contra o FGFR3 aqui no blog, mas na Tabela 1, você verá uma lista mais recente delas.

Tabela 1. Alguns TKIs recentes com atividade contra os FGFRs.

Para entender melhor como essas pequenas moléculas funcionam convido você a assistir a esta rica animação que mostra o mecanismo de ação do lapatinib (Animação 2), um TKI desenvolvidos para bloquear EGFRs, outra classe de enzimas que trabalham de forma semelhante aos FGFRs. Você verá que o lapatinib tem como alvo os bolsos de ATP na parte intracelular do EGFR.

Animação 2. Mecanismo de ação do lapatinib (áudio em italiano). 

Utilizar TKIs na acondroplasia?

Uma vez que existem tantas moléculas capazes de bloquear a atividade do FGFR3, por que não vemos mais pesquisas abordando o seu uso na acondroplasia? Esses medicamentos podem ser tomados como comprimidos, uma vez por dia. Não seria perfeito? O problema é que, como mencionado acima, os bolsos de ATP (os domínios de tirosina-quinase) são muito semelhantes em um grande número de famílias de enzimas que trabalham como os FGFRs. Você notou que eu não escrevi FGFR3 no título Tabela 1? Isto é porque nenhum desses compostos lá enumerados são específicos para o FGFR3. Eles também podem bloquear a atividade de outros FGFRs e de outras enzimas celulares. Para ilustrar esse recurso do TKIs, dê uma olhada no mapa das famílias de enzimas abaixo (Figura 3), que mostra os grupos de enzimas que alguns TKIs são capazes de bloquear.

Figura 3. Mapa das enzimas mostrando enzimas afetadas por alguns dos mais velhos TKIs. Cada ponto colorido significa que o TKI terá alguma ação sobre aquela enzima. Note-se a forma como o mapa é desenhado, como uma árvore vista de cima

Note o grande número de enzimas afetadas por esses TKIs. Imagem de:Stjepanovic N & Capdevila J. Biologics: Targets and Therapy 2014. Acesso livre. Reproduzido aqui apenas para fins educacionais.

Afetar diversas enzimas diferentes e suas funções, ao mesmo tempo, pode representar um enorme problema. Vários efeitos indesejados podem surgir quando essas drogas são utilizadas para tratar o câncer. No entanto, alguns dos efeitos adversos são toleráveis ​​ou aceitáveis devido à natureza da doença, e também porque, apesar de afetar várias enzimas ao mesmo tempo, inibidores de tirosina-quinase tendem a ser menos tóxicos do que o arsenal de quimioterapia mais antigo que continua a ser usado hoje em dia para lutar contra o câncer.

De fato, muitos TKIs como os acima mencionados já estão sendo utilizados na prática clínica para o tratamento de várias formas de câncer, mas apenas em adultos. Como sua atividade é promíscua podemos prever que os TKIs poderiam ser perigosos para o uso em crianças, cujos corpos estão em crescimento. Essas enzimas participam de processos fundamentais de desenvolvimento e bloqueá-las em uma criança poderia causar muitas consequências ruins.

Pesquisadores como o Dr. Moosa Mohammadi, da New York University, e a Dr Kalina Hristova, da Johns Hopkins University , tem trabalhado duro para entender melhor o grupo de enzimas FGFRs e/ou os bolsos de ATP. Eles criam modelos computadorizados em 3D das enzimas, tentando mapear onde os aminoácidos estão localizados para que possam prever como estas enzimas trabalham e assim ajudar a serem desenvolvidas novas moléculas para caber nos lugares certos, embora isto não seja fácil de fazer. Você pode ver o trabalho do Dr. Mohammadi fazendo uma simples pesquisa no Pubmed.

Os anti-FGFR atuais não podem ser utilizados para tratar a acondroplasia

Talvez devido aos riscos previsíveis, é improvável que os atuais inibidores da tirosina-quinase possam ser utilizados na acondroplasia. Há evidências em testes de laboratório que eles funcionam (1), mas, por causa de sua falta de especificidade, esses TKIs não são candidatos a chegar serem utilizados clinicamente para tratar a acondroplasia.

Para trazer mais dados sobre a utilização de TKIs na acondroplasia, o grupo liderado pelo Dr. Pavel Krejci, um pesquisador entusiástico na área do FGFR3, acaba de publicar um convincente estudo no qual exploraram exatamente o uso de alguns desses TKIs conhecidos por serem mais específicos para as enzimas da família FGFR em condrócitos e culturas de osso (2). Alguns dos inibidores de tirosina-quinase testados no seu trabalho estão listados na Tabela 1 acima. Após a realização de uma longa série de testes, tanto em culturas de células, cultura de osso e em modelos animais, o grupo concluiu que seria arriscado usar os atuais TKIs em desenvolvimento na acondroplasia, exatamente porque eles bloqueiam outras enzimas importantes para o desenvolvimento do organismo em crescimento.

Exclusividade é difícil de alcançar

Para entender por que essas moléculas criadas para bloquear os bolsos de ATP afetam várias enzimas, vamos voltar ao mapa das enzimas acima e conferir a sua distribuição. Você notará que as hastes das famílias des enzimas surgem de um tronco principal, como em uma árvore. Isto significa que, embora existam centenas de enzimas diferentes hoje, todas eles vieram de alguns poucos antepassados, e por isso mantém uma grande semelhança entre si, o que é chamado pelos cientistas de homologia. Os quatro FGFRs são muito semelhantes, compartilhando mais de 50% da sua estrutura entre os quatro membros (3).

Como assinalado por vários investigadores, incluindo o Dr. Krejci, uma molécula bem sucedida do grupo TKI para o tratamento da acondroplasia terá de ser muito seletiva para o FGFR3, com nenhum efeito nas proteínas irmãs ou em enzimas de outros grupos. Isso vai levar ainda algum tempo mais para se alcançar, e o sucesso será baseado, pelo menos em parte, em aperfeiçoar a capacidade de projetar modelos de enzimas no computador que sejam capazes de simular seu estado natural e sua dinâmica na célula viva.

Isto apenas significa que precisamos estar abertos para as várias opções disponíveis para enfrentar enzimas hiperativas como o FGFR3 na acondroplasia. Bolsos de ATP têm sido os alvos mais pesquisados ​​porque eles são fáceis de atingir. No entanto, existem outros locais na estrutura da proteína que podem ser abordados. Convido você a rever os artigos anteriores no blog. Você vai descobrir que há muitas idéias por aí, esperando por um desenvolvedor que não esteja pensando somente nos alvos mais fáceis de alcançar.

Referências

1. Jonquoy A et al. A novel tyrosine kinase inhibitor restores chondrocyte differentiation and promotes bone growth in a gain-of-function Fgfr3 mouse model. Hum Mol Genet 2012;21(4):841-51. Free access.

2. Gudernova I et al. Multikinase activity of fibroblast growth factor receptor (FGFR) inhibitors SU5402, PD173074, AZD1480, AZD4547 and BGJ398 compromises the use of small chemicals targeting FGFR catalytic activity for therapy of short stature syndromes. Hum Mol Genet 2015 Oct 22. pii: ddv441. [Epub ahead of print].

3. Ho HK et al. Current strategies for inhibiting FGFR activities in clinical applications: opportunities, challenges and toxicological considerations. Drug Discov Today 2014 Jan;19(1):51-62.

Treating achondroplasia: the role of Tyrosine Kinase Inhibitors

Introduction

Achondroplasia is caused by a mutation in the gene that encodes (contains the chemical information to create) the protein called fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3). FGFR3 is a protein that is located across the cell membrane of the chondrocytes (Figure 1). It has three parts or domains: the part outside the cell that works like an antenna, receiving signals from FGFs; the transmembrane domain, which "anchors" the protein across the cell wall; and the intracellular domain, which is responsible for spreading the signal received outside the cell to other proteins inside the cell. 

Figure 1. FGFR3 structure

Proteins are large and complex molecules constituted by smaller parts called amino acids. These amino acids are like pieces in a Lego model: each one has distinct features which, combined with others, confer special shapes and properties to the protein (Figure 2). The right combination of amino acids is therefore essential for the normal function of the protein. If you are curious about amino acids, just visit the Glossary page of the blog for some basic information or go to Wikipedia)

Figure 2. Combining Lego parts

The right combination of amino acids in a protein is crucial for its proper function. In achondroplasia a single substitution (the mutation) of one of these amino acids gives more power (activity) to FGFR3 than it was supposed to have. The normal function of FGFR3 is to reduce the speed of bone growth at the level of some tiny structures in the end of the long bones called growth plates. Because of the mutation, FGFR3 is working too much and causes a significant impairment in the ability of the chondrocytes living in the growth plates to multiply and mature, leading to the clinical features of achondroplasia.

Why is that so?

We refer to proteins that participate in chemical reactions in the body as enzymes. Enzymes are very active and FGFR3 is not different. To control the enzymes' activities the cells have "cleaning" (janitor) systems that allow those enzymes, when turned on (or activated), to work only for a limited period of time. In achondroplasia, the mutation makes FGFR3 more stable and "resistant" to these janitors, so it keeps working longer.

Well, what does it have with the title of this article? 

Calm down, we are getting there.

An enzyme works by transferring electric charges to another protein (a client that could be another enzyme), causing changes in the client. The client will take the electric charge to another destination, for instance, another protein, a given spot inside the cell nucleus, etc. It will depend on their function(s). Think in a domino chain, a piece pushing the next one, etc. This is the way cells work. To help you understand enzymatic chemical chain reactions or signaling cascades, I invite you to watch the fine animation below provided by Cold Spring Harbor Laboratory that I published in a previous article of the blog (Animation 1). 

Animation 1. This animation shows how the body starts the healing process after a skin bruise. The relevant part starts at 2:50 min, showing how a ligand (think on a FGF) binds to a receptor enzyme on the surface of a cell (think on FGFR3) and starts the signaling or chemical cascade.

DNA Learning Center by Cold Spring Harbor Laboratory

Enzymes are capable to transfer those electric charges because some of the amino acids in their structures have the right chemical properties to do so. In the case of FGFR3, there are some spots in its part that is located inside the cell occupied by the amino acid tyrosine (see Figure 1). Tyrosine can bind to some reactive phosphorus carriers (ATP) fluctuating nearby inside the cell but will only do so if FGFR3 is activated (turned on). When FGFR3 is turned on outside the cell (did you see the animation 1?), through several complex shape changes, it exposes the tyrosines in its intracellular part, which in turn attract the phosphorus nearby, starting a series of chemical reactions. You must take in account that I am simplifying a lot the "activation" phenomenon here. 

The regions where the tyrosines are located in FGFR3 are called  "ATP pockets". These boxes are well used by many other enzymes with many different functions in the cells, so these structures are not exclusive of FGFR3. We also call these regions tyrosine kinase domains (TKD) (Figure 1). 

Ok, finally we see a connection with the title!

For decades, scientists know about these ATP pockets. They found that in cancer many of the enzymes like FGFR3 are used by the malignant cells to let them grow more and faster, so they started to search for approaches that would be capable to block them. In theory, without the chemical reactions provided by enzymes like FGFR3, many cancer cells would die and the disease could potentially be controlled.

In fact, scientists have already developed a lot of strategies to achieve this goal. One of them is exactly through creating molecules that can bind the TKD, preventing the enzyme to start chemical reactions. These molecules are called tyrosine kinase inhibitors (TKI). We have already reviewed many of those which have activity against FGFR3 here in the blog, but in Table 1 you will see a more recent list of them.

 Table 1. Some recent TKIs with activity against FGFRs.

To better understand how these small molecules work I invite you to watch this rich animation showing the mechanism of action of lapatinib (Animation 2), a TKI developed to block EGFRs, another class of enzymes that work in a similar way FGFRs do. You will see that lapatinib targets the ATP pockets in the intracellular part of EGFR.

Animation 2. Lapatinib mechanism of action (audio in Italian).
 

Using TKIs in achondroplasia?

Since there are so many molecules capable to block the activity of FGFR3, why don't we see more research addressing their use in achondroplasia? These drugs can be taken as pills once a day. Wouldn't it be perfect? The problem is that, as mentioned above, the ATP pockets (the tyrosine kinase domains) are very similar in a large number of families of enzymes that work like FGFRs. Did you notice that I didn't write FGFR3 in the Table 1 title? This is because neither of those compounds listed there are specific for FGFR3. They can also block the activity of other FGFRs and other cell enzymes. To illustrate this feature of the TKIs, take a look into the enzyme families' map below (Figure 3), showing the groups some TKIs are capable of blocking.

Figure 3. Kinome map showing enzymes affected by some old TKIs. Every colored point means that the given TKI will have some action on that enzyme. Note the way the map is designed, like a tree seen from above.

Note the large number of enzymes affected by these TKIs. Picture from: Stjepanovic N & Capdevila J. Biologics: Targets and Therapy 2014. Open access. Reproduced here for educational purposes only.

Affecting several different enzymes and their functions, at the same time, may pose a huge problem. Several undesired effects may arise when these drugs are used to treat cancer. However, some of the adverse effects are tolerable or acceptable because of the nature of the disease and also because, although affecting several enzymes at the same time, TKIs tend to be less toxic than the older chemotherapy arsenal that is still being used today to fight cancer.

In fact, many TKIs like these are already being used in the clinic to treat several forms of cancer, but only in adults. With the promiscuous activity they have we can predict TKIs could be dangerous to use in the growing bodies of children. These enzymes participate in fundamental development processes and blocking them in a child could cause many bad consequences.

Researchers like Dr Moosa Mohammadi, from University of New York, and Dr Kalina Hristova, from Johns Hopkins University, have been working hard to better understand the FGFR group of enzymes and the ATP pockets. They create computerized 3D models of the enzymes, trying to map where the amino acids are located so they can predict how these enzymes work and help new molecules to be developed to fit in the right places, but this is not easy to do. You can see the work by Dr Mohammadi doing a simple search in Pubmed.

Current anti-FGFRs cannot be used to treat achondroplasia

Perhaps because of the predicted risks it is unlikely that the current TKIs could be used in achondroplasia. There is evidence in lab tests that they work (1) but, because of their lack of specificity, TKIs are unlikely to reach the clinic for indications such as achondroplasia.

To bring more data about TKIs' utility for achondroplasia, the group leaded by Dr. Pavel Krejci, an enthusiastic researcher in the FGFR3 area, has just published a compelling study where they explored exactly the use of some of these TKIs known to be more specific to the FGFR family in chondrocytes and bone cultures (2). Some of the TKIs tested in their work are listed in Table 1 above. After performing a long series of tests, both in cell cultures, bone culture and animal models they concluded that the current TKIs in development would be risky to use in achondroplasia exactly because they block other enzymes important for the development of the growing body.

Exclusivity is difficult to achieve

To understand why these molecules created to block the ATP pockets affect several enzymes at the same time it is good to go back to the enzymes' map above and look their distribution. You will note that there are some family stems that arise from a main one, like in a tree. This means that although there are hundreds of different enzymes today, they all came from few ancestors, so they carry a lot of similarity, which is called by scientists as homology. The four FGFRs are very similar in structure, with more than 50% of their structure shared among the four members (3).

As pointed by several investigators, including Dr. Krejci, a successful molecule of the TKI group for the treatment of achondroplasia will have to be very selective for FGFR3, with no effect in the sister proteins and in enzymes of the other enzyme groups. This will take some time more to achieve, and will be based, at least in part, in perfecting the ability to design computer models of enzymes able to simulate their natural state and dynamics in the living cell. 

This just means that we need to be open to the several options available to tackle overactive enzymes like FGFR3 in achondroplasia. ATP pockets have been the most researched targets because they are easy to work with. However, there are other sites in the protein structure that can be approached. I invite you to review previous articles in the blog. You will find that there are many ideas around, waiting for a developer not thinking only in the low hanging fruit.

References

1. Jonquoy A et al. A novel tyrosine kinase inhibitor restores chondrocyte differentiation and promotes bone growth in a gain-of-function Fgfr3 mouse model. Hum Mol Genet 2012;21(4):841-51. Free access.

2. Gudernova I et al. Multikinase activity of fibroblast growth factor receptor (FGFR) inhibitors SU5402, PD173074, AZD1480, AZD4547 and BGJ398 compromises the use of small chemicals targeting FGFR catalytic activity for therapy of short stature syndromes. Hum Mol Genet 2015 Oct 22. pii: ddv441. [Epub ahead of print].

3. Ho HK et al. Current strategies for inhibiting FGFR activities in clinical applications: opportunities, challenges and toxicological considerations. Drug Discov Today 2014 Jan;19(1):51-62.