O blog tem atualmente 24 seguidores (é o que Google diz ...). Esses resilientes leitores provavelmente pensam que eu repito demais a mesma informação, pois os artigos muitas vezes começam com conceitos básicos sobre a acondroplasia antes de entrar no assunto. Isso é verdade, mas eu sei que às vezes outros visitantes passam por aqui, então é bom tentar colocar todos no mesmo passo. E, afinal de contas, sempre procuro incluir algo novo nessas introduções (e isso é verdade nesta aqui, também!).
Lendo novamente os artigos mais recentes, percebo que a linguagem e explicações, por vezes, podem parecer difíceis de entender para o leitor de primeira viagem. Se você acha que está sendo difícil entender alguns dos temas comentados aqui, dê uma olhada nos primeiros artigos do blog, escritos em 2012. Eles podem ajudar a trafegar mais facilmente através dos novos. Por exemplo, o tema deste artigo foi revisto em três artigos de 2012:
24/01/2012. Mirando na produção do FGFR3 para resgatar o crescimento ósseo na acondroplasia
12/02/2012. O mundo do RNA: desligando o FGFR3 na acondroplasia
20/02/2012. O mundo do RNA: desligando o FGFR3 na acondroplasia, parte 2
E, em 2013, escrevi um outro artigo sobre este assunto:
18/06/2013. Interferindo na produção do FGFR3: uma potencial estratégia para tratar a acondroplasia
Pode ser útil você lê-los antes de continuar aqui, porque o tema tem suas complexidades.
Algumas informações básicas
A acondroplasia é causada por uma mutação no gene FGFR3, o qual codifica a (contem as instruções para a produção de) proteína chamada receptor de fator de crescimento de fibroblastos 3 (FGFR3) (1,2). O FGFR3 tem um papel fundamental no desenvolvimento ósseo, que é o de reduzir a velocidade de crescimento do osso (3). Ele funciona como um freio no interior das estreitas regiões localizadas em ambas as extremidades dos ossos longos chamadas de placas de crescimento (Figura 1). As placas de crescimento são as estruturas responsáveis pelo alongamento dos ossos tubulares (ou longos). As células no interior da placa de crescimento, os condrócitos, são responsáveis pelo crescimento do osso através de um processo muito complexo, e o FGFR3 é parte dele.
Figura 1. A placa de crescimento.
Nas Figuras 1 e 2 você pode ver que os condrócitos da placa de crescimento são posicionados de uma forma que, sob estímulo contínuo de muitos agentes de crescimento ativos (FGFR3 incluído), partem de um estado de repouso (resting zone), passam por um organizado frenesi proliferativo (proliferative zone), são submetidos a um aumento maciço de volume (hypertrophic zone) e, finalmente, dão lugar às células responsáveis pela construção do novo osso, os osteoblastos. Como um pequeno detalhe, alguns autores em revisões recentes têm considerado que o tamanho da zona hipertrófica é determinante para o alongamento do osso (4).
Figura 2. O ciclo de vida dos condrócitos e muitos dos agentes que participam no desenvolvimento do crescimento ósseo.
Como mencionado acima, o FGFR3 atua para equilibrar o efeito de vários outros agentes que estimulam a proliferação de condrócitos. Se não houvesse FGFR3, os ossos cresceriam excessivamente causando problemas de saúde, como vemos em casos relatados na literatura (5).
No entanto, na acondroplasia, a mutação no gene FGFR3 faz o FGFR3 ficar mais ativo do que o normal, o que por sua vez leva à interrupção do crescimento do osso. Sob o efeito de um FGFR3 superativo, condrócitos reduzem sua taxa de proliferação e menos deles sofrem hipertrofia (Figura 3). Com menos condrócitos amadurecendo e crescendo, a zona hipertrófica não atinge o seu pleno potencial e temos comprometimento do crescimento ósseo. Basicamente, quase todas as características clínicas e consequências para a saúde na acondroplasia podem ser explicadas por este mecanismo (4).
Figura 3. Placas de crescimento de um modelo de rato com acondroplasia (direita) e de um animal não afetado (à esquerda).
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| Compare os comprimentos das zonas proliferativas (PZ) e hipertroficas (HZ) entre as placas de crescimento normal e afetada. Adaptado e reproduzido aqui de Yingcai W et al. PNAS 1999;96:4455-60, somente para fins educativos. |
Figura 4. As cascatas químicas intracelulares do FGFR3 (da Nature Reviews Cancer 2005).
Os cientistas têm agora uma boa compreensão de como o FGFR3 exerce a sua ação nos condrócitos, os "botões" que aperta para fazer os condrócitos pararem de crescer, embora não raro tragam mais detalhes para este processo.
Aprender sobre o mecanismo de ação das proteínas, tais como o FGFR3, é como criar um mapa com estradas destacando seus cruzamentos, pontos de checagem, estações de trem etc. Esse mapeamento permite que os pesquisadores trabalhem em soluções para superar a falta ou excesso de atividade dessas proteínas. Muitas terapias atuais para um grande número de doenças têm sido criadas com a ajuda desses mapas, uma vez que ajudam a encontrar os alvos corretos para combater uma determinada condição médica.
Pensando em terapias para a acondroplasia, como também para outras muitas doenças genéticas causadas por uma única proteína hiperativa, o movimento natural é o de encontrar um agente que possa interromper essa proteína de exercer a sua função. Teoricamente, isso poderia ajudar a reverter ou minimizar os seus efeitos.
Pode-se conseguir interromper a ação do FGFR3 por várias vias diferentes (olhe as "estações de trem" no mapa da cascata de sinalização na Figura 3), desde bloquear a recepção do sinal pela antena ou pelo bloqueio dos botões no painel de controle até o de contrabalançar o efeito de uma daquelas cascatas químicas, através do estímulo de uma cascata antagonista.
A maioria dessas estratégias já foi revista aqui no blog. Por exemplo, você pode bloquear a antena com anticorpos concebidos para conectarem-se a ela. Existem pelo menos três anticorpos contra o FGFR3 publicados na literatura, os quais têm sido explorados em estudos clínicos para o câncer ativado por FGFR3 (veja este artigo).
Você pode bloquear os botões no painel de controle com pequenas moléculas chamadas inibidores de tirosina quinase (TKI). Há muitos TKI disponíveis, mas até agora nenhum bom o suficiente para ser usado na acondroplasia (veja este artigo). E você também pode estimular outra antena da célula (outro receptor) para reduzir a atividade do FGFR3, como observamos com o vosoritide, um análogo do peptídeo natriurético tipo C (CNP), atualmente em um estudo clínico de fase 2 para a acondroplasia.O vosoritide imita o CNP ao se ligar ao seu receptor localizado na membrana celular do condrócito (como o FGFR3). O receptor é ativado e sua sinalização intercepta a MAPK, a principal cascata de sinalização do FGFR3, inibindo-a ao nível da "estação de trem" RAF (Figura 5) (veja este artigo).
Figura 5. A cascata de sinalização do CNP intercepta a cascata MAPK desencadeada pelo FGFR3.
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| Matsushita M et al. (2013). PLoS ONE 8 (12): e81569. Reproduzido aqui apenas para fins ilustrativos |
Estes são apenas alguns exemplos entre outras diversas estratégias que já estão sendo exploradas para a acondroplasia (veja este artigo). No entanto, há outros tipos de abordagem que poderiam ser adequadas para controlar ou regular o FGFR3 e, depois desta longa introdução, vamos falar sobre uma delas, que seria a de bloquear a produção do FGFR3 (está no título, não é?). Na verdade, já a revisamos aqui no blog (os artigos noa no topo deste texto!, você chegou a lê-los?), Mas como há nova informação chegando, pensei que valeria a pena falar sobre ela novamente. Afinal, essa estratégia poderá nos ajudar a entrar em outra nova estratégia potencial que também lida com DNA, RNA e a maquinaria de transcrição de genes mais adiante.
Regulando o regulador
Como você deve saber, nosso DNA é uma espécie de cofre onde a informação química necessária para criar as proteínas fundamentais para o nosso corpo é armazenado. A vida é um processo dinâmico e existe sempre a necessidade de produzir novas proteínas de modo que as células, tecidos e o corpo como um todo possam funcionar normalmente (Animação 1, Inglês, 2:41min).
Animação 1. Do DNA à proteína (yourgenome.org).
A forma como o processo pelo qual o DNA é "lido" e "copiado" para gerar proteínas frequentemente pode conduzir a estados em que um determinado gene que codifica a informação para gerar uma proteína poderia ficar longamente "aberto" para ser "lido", de modo que a proteína poderia ser produzida sem parar. Isto, por sua vez, pode resultar em problemas de saúde. Por exemplo, alguns tipos de células cancerosas, como no câncer de mama, são capazes de iniciar a superprodução de "antenas", tais como o nosso FGFR3, para captar mais sinais externos em circulação que estimulam ainda mais o crescimento do câncer.
Em condições normais, este excesso de produção de proteínas não ocorre porque a célula tem várias medidas de controle de qualidade que funcionam para regular este processo. Uma delas é constituída por moléculas de RNA.
Mas, vamos devagar aqui, passo a passo. Lembro-me que, nos meus tempos de colégio, quando comecei a estudar biologia celular, havia três tipos clássicos de RNA: RNA mensageiro (mRNA), o RNA de transferência (tRNA) e o RNA ribossomal (todos eles aparecem na animação acima). Bem, desde então, a lista de tipos de RNA não parou de crescer. Dê uma olhada nesta página da Wikipedia (em inglês) para obter uma lista de tipos de RNA já identificados.
Algumas destas moléculas de RNA estão muito envolvidas no processo de controle da produção de proteínas e o foco aqui é a família microRNA, ou simplesmente miRNA (revisto nos artigos mencionados acima). Demonstrou-se que essas moléculas de RNA controlam a quantidade de proteínas produzidas pela célula. Convido você a assistir à Animação 2 (Inglês, 4:53min) por Katarina Petsche, a qual dá uma visão global da síntese do miRNA e de como ele funciona:
Animação 2. A síntese e mecanismo de ação do miRNA (por Katarina Petsche).
Basicamente, devido à capacidade de degradação de mRNAs, os miRNAs têm sido classificados como moléculas "silenciadoras de genes". Como a proteína-alvo não é produzida, é como se o gene não estivesse funcionando (ou desligado, silenciado).
Há milhares de miRNAs diferentes e cada um deles foi concebido para se ligar a um número limitado de mRNAs. Já se identificou vários miRNAs, tais como o miRNA-100 (ou miR-100), que se ligam ao mRNA do FGFR3, mas aqui temos um problema. Embora os miRNAs sejam muito específicos para os seus alvos, seus alvos não são únicos. Quando você pensa em "silenciamento" de um gene específico, digamos o FGFR3 na acondroplasia, não quer "silenciar" outros genes-alvo, uma vez que isso poderia levar a outros problemas de saúde.
Entre os vários miRNAs que mostraram exercer uma função de controle sobre o FGFR3, o miR-100 parece ser um dos mais relevantes, uma vez que há evidências de que ele realmente controla o FGFR3. Diversos estudos publicados recentemente exploraram a ligação entre o miR-100 e o FGFR3 no câncer pancreático (7), glioblastoma (8), sarcoma (9) e em células de câncer de pulmão (10) e mostraram que, nas células que "superproduzem" miR-100 havia menos FGFR3 disponível e vice-versa, e todos concluíram que o miR-100 foi capaz de inibir o crescimento do câncer nas suas experiências. Não se sinta confuso sobre o fato de que o FGFR3 é usado pelas células cancerosas paraa crescer. Isso acontece porque o FGFR3 é um freio somente para os condrócitos da placa de crescimento; em outras células ele funciona como um acelerador ... Estes tipos de descobertas podem conduzir ao desenvolvimento de uma estratégia de estímulo de expressão (de produção) de miR-100 nas células de câncer que utilizam o FGFR3 para crescer, para silenciar o gene FGFR3 e combater o tumor.
Então, se uma abordagem como essa poderia ser usada para o tratamento do câncer, o miR-100 ou outros miRNAs são adequados para tratar a acondroplasia?
Provavelmente não, porque, embora exista evidência de que eles inibem o FGFR3, também existem outras proteínas que podem ser afetadas por suas ações, o que poderia trazer problemas indesejáveis. Em resumo, miRNAs não são suficientemente específicos.
Bem, então, qual é o objetivo desta revisão? A coisa é que os pesquisadores foram capazes de criar, em laboratório, um outro tipo de RNA que faz basicamente o mesmo que que os miRNAs (aprender um pouco sobre um, é aprender sobre o outro...). No entanto, há uma diferença importante: como é sintetizado no laboratório, provavelmente terá especificidade muito maior para o FGFR3. Esta molécula de RNA sintética é chamada de pequeno RNA de interferência (small interference RNA) ou simplesmente siRNA. Estudos já realizados mostram que siRNAs usam a mesma maquinaria celular e causam efeitos similares aos dos miRNAs (11). Os investigadores têm de introduzir o siRNA no interior da célula e depois ele funciona como um miRNA. Hoje em dia, uma abordagem "simples" para provar que um gene é ligado a uma determinada função é a de aplicar um siRNA específico e observar os efeitos de silenciamento daquele gene. Por exemplo, isso foi feito em diversos contextos de doenças (11) e também na acondroplasia, em um estudo realizado por Pintor e Legeai-Mallet (12).
Se você leu o artigo de 2013 sobre RNAs você já sabe que pelo menos uma empresa de biotecnologia com sede nos EUA (Marina Biotech) patenteou uma estratégia de interferência de RNA como possivelemtne útil para o tratamento de acondroplasia (13). Agora, descobri uma outra patente para o uso de moléculas de ácidos nucleicos para tratar a acondroplasia (14) (Santaris Pharma, Roche), então parece que tem havido algumas tentativas recentes para atingir o FGFR3 na acondroplasia usando a estratégia siRNA.
Não sabemos se estas abordagens chegarão ao desenvolvimento clínico porque um dos principais desafios para as terapias à base de ácidos nucleicos (RNA é composto por ácidos nucleicos, como você sabe) é como fazer esses agentes atingirem os seus objetivos. Como as moléculas de RNA são tão poderosas, o corpo tem um grande número de agentes de proteção para garantir que essas moléculas não trafegarão livremente por muito tempo. RNA é o código genético de muitos vírus causadores de doença, e o corpo deve estar pronto para se livrar de ácidos nucleicos estranhos para se defender de infecções. Portanto, as moléculas de RNA tendem a ser rapidamente degradados por enzimas neutralizantes, e isto poderia explicar em parte por que não vemos progressos rápidos nesta área. Para a acondroplasia, o desafio é ainda maior porque as células-alvo, os condrócitos, estão em um ambiente muito bem protegido, a cartilagem da placa de crescimento, um lugar difícil de alcançar (ver este artigo anterior do blog).
Entregando a encomenda
A entrega a domicílio é realmente um desafio, e por esta razão usei o verbo "introduzir" quando eu descrevi o uso do siRNA três parágrafos acima. Não é fácil fazer moléculas de RNA chegarem ao interior das células, você precisa usar um táxi (o que se chama de transportador, vetor etc.) ou um disfarce. Por exemplo, em vários estudos foram aplicados apêndices na molécula de RNA, o que as tornou mais estáveis e resistentes à neutralização por enzimas. Em doenças em que a célula alvo está num tecido com fluxo direto de sangue, isto pode ser suficiente para permitir que o siRNA entre na célula, mas em um tecido, tal como a placa de crescimento, onde não existe um fluxo sanguíneo direto, como isso pode ser alcançado?
Esta não é uma questão trivial. Uma estratégia possível para fazer uma droga chegar ao seu alvo é encontrar algo que somente esse alvo tem (como um marcador), o que não é uma tarefa fácil, mas ainda assim viável. No caso dos condrócitos da placa de crescimento possivelmente um destes marcadores é um receptor de células (outra antena) chamado CD44. O problema aqui é que o CD44 é expresso por muitas células diferentes. Então, é inútil? Talvez não, porque a maioria das células que possuem CD44 não expressam FGFR3 em um nível significativo, de modo algum influência de um siRNA contra o FGFR3 nelas possivelmente não iria causar qualquer problema. A ideia seria anexar ou cobrir a molécula de RNA a uma outra molécula que pode ligar-se ao CD44. Uma vez ligado, o sistema celular que mantem o equilíbrio das antenas traria este CD44 ocupado para o interior da célula, onde o siRNA seria liberado para encontrar o seu alvo e exercer a sua função esperada. Esta é apenas uma ideia pessoal, nunca encontrei qualquer trabalho que explorasse esta abordagem nesta área específica.
Conclusão
Pode parecer que esta revisão não ajudou muito em termos de trazer uma nova terapia potencial espetacular para acondroplasia. Seria mais como uma revisão geral da doença, uma vez que o blog já tem artigos sobre miRNAs e siRNAs. No entanto, não estamos perdendo tempo: os processos brevemente mencionados aqui servirão para ajudar-nos a viajar por um ainda mais complexo, que é a edição de genes, uma estratégia terapêutica potencial que está sob os holofotes agora.
Poderia ser usada para tratar a acondroplasia?
Pelo que eu já aprendi, diria que sim, mas vamos ver no próximo artigo. Ainda estou estudando este tópico ...
Referências
1.Bellus GA et al. Achondroplasia is defined by recurrent G380R mutations of FGFR3. Am J Hum Genet 1995;56(2):368-73. Free access.
2.Rousseau F et al. Mutations in the gene encoding fibroblast growth factor receptor-3 in
achondroplasia. Nature 1994;371(6494):252-4. Free access.
3. Laederich MB and Horton WA. FGFR3 targeting strategies for achondroplasia.Expert Rev Mol Med 2012;14:e11.
4. Narayana J and Horton WA. FGFR3 biology and skeletal disease. Connect Tissue Res 2015;56(6):427-33.
5. Makrythanasis P et al. A novel homozygous mutation in FGFR3 causes tall stature, severe lateral tibial deviation, scoliosis, hearing impairment, camptodactyly, and arachnodactyly. Hum Mutat 2014;35(8):959-63.
6. Ornitz DM and Marie PJ. Fibroblast growth factor signaling in skeletal development and disease. Genes Dev. 2015 Jul 15;29(14):1463-86. Free access.7. Li Z et al. MicroRNA-100 regulates pancreatic cancer cells growth and sensitivity to chemotherapy through targeting FGFR3. Tumour Biol 2014;35(12):11751-9.
8. Luan Y et al. Overexpression of miR-100 inhibits cell proliferation, migration, and chemosensitivity in human glioblastoma through FGFR3. Onco Targets Ther 2015;8: 3391-400. Free access.
9. Bi Y et al. Overexpression of miR-100 inhibits growth of osteosarcoma through FGFR3.Tumour Biol 2015;36(11):8405-11.
10. Luo J et al. Overexpression of miR-100 inhibits cancer growth, migration, and chemosensitivity in human NSCLC cells through fibroblast growth factor receptor 3.Tumour Biol 2015; published online Aug 28. DOI 10.1007/s13277-015-3850-z.
11.Videira M et al. Preclinical development of siRNA therapeutics: towards the match between fundamental science and engineered systems.Nanomedicine 2014;10(4):689-702.
12. Guzman-Aránguez A, Legeai‐Mallet L, Pintor J. Fibroblast growth factor receptor 3 inhibition by small interfering RNAs in achondroplasia. Anales Real Acad Nac Farm 2011; 77(1).
13. Marina Biotech Patent WO 2011139842 A2. Nucleic acid compounds for inhibiting fgfr3 gene expression and uses thereof.
14. Santaris Pharma WO 2014080004 A1. Compositions and methods for modulation of fgfr3 expression.
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